張 璇，鵬越峰，蔡青青

(1.深圳市精神衛(wèi)生中心，廣東深圳 518020;2.深圳市心理健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東深圳 518020;3.中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院，廣東深圳 518055)

隨著基因治療的不斷深入，非病毒基因載體的研究越來(lái)越受到人們的重視，陽(yáng)離子聚合物是近年發(fā)展起來(lái)的一種新型非病毒基因載體，由于其表面存在大量的陽(yáng)離子電荷，通過(guò)與siRNA或DNA鏈上負(fù)電性的聚電解質(zhì) (磷酸根)的靜電作用締合成復(fù)合物，從而保護(hù)siRNA或DNA使其免受核酸酶的降解，在此過(guò)程中，含目的基因的質(zhì)粒體積會(huì)被高度壓縮成50～200 nm大小的納米球，大大增強(qiáng)了對(duì)細(xì)胞膜的穿透能力［1－2］。聚丙烯亞胺 (Poly(propylenimine)，PPI)樹(shù)狀聚合物1993年首次被合成出來(lái)，它的大小由代數(shù)來(lái)標(biāo)明，并隨代數(shù)增加而增加［3－4］。與聚酰胺 － 胺樹(shù)狀聚合物 (Poly(amidoamine)，PAMAM)一樣，PPI樹(shù)狀聚合物有聚胺的典型結(jié)構(gòu)，外部為伯胺基團(tuán)，內(nèi)部為叔胺基團(tuán)。與DNA的結(jié)合能力是PPI發(fā)揮轉(zhuǎn)染作用的先決條件，研究發(fā)現(xiàn)［5］，隨著代數(shù)的增加，與DNA的結(jié)合能力增強(qiáng)，但PPI的毒性會(huì)隨代數(shù)的增加而急劇增加，這大概是PPI到目前為止沒(méi)有像PAMAM一樣被廣泛研究的原因之一。許多學(xué)者嘗試著對(duì)低代數(shù)的PPI進(jìn)行化學(xué)修飾以改善其作為基因載體的性能［6－8］。

具有支化結(jié)構(gòu)的聚合物，尤其是樹(shù)狀大分子，表現(xiàn)出的性能是傳統(tǒng)線性聚合物所不能達(dá)到的［9］，為了減少毒性并且保持較高的轉(zhuǎn)染率，許多學(xué)者研究設(shè)計(jì)出可生物降解的偽樹(shù)狀大分子材料 (pseudodendrimers)，Russ等［10］以較小相對(duì)分子質(zhì)量的PEI(oligoethylenimine，OEI)為核，通過(guò)二丙烯酸酯將包括OEI在內(nèi)的低聚胺連接在OEI表面，以形成可生物降解的，富含氨基的大分子聚合物，此大分子聚合物不僅表現(xiàn)出很好的DNA結(jié)合能力和轉(zhuǎn)染效率，而且具有明顯的腫瘤靶向性。Chen等［11］以O(shè)EI為核，合成了多分枝的聚谷氨酸骨架，再將OEI接枝到聚谷氨酸骨架表面，此大分子聚合物在不同細(xì)胞系中都表現(xiàn)出優(yōu)于PEI25K的轉(zhuǎn)染效率，其轉(zhuǎn)染效率受血清的影響很小。然而，OEI結(jié)構(gòu)的不對(duì)稱性使以O(shè)EI為核的偽樹(shù)狀大分子并沒(méi)有典型的樹(shù)狀大分子的對(duì)稱結(jié)構(gòu)。

本研究擬對(duì)第二代樹(shù)狀大分子PPI表面進(jìn)行修飾，使其表面接枝上聚谷氨酸芐酯，合成結(jié)構(gòu)對(duì)稱的多臂聚谷氨酸芐酯材料，通過(guò)對(duì)樹(shù)狀大分子的結(jié)構(gòu)進(jìn)行可控設(shè)計(jì)，從而大大增加載體的生物相容性及生物可降解性，降低其毒性，使其有望成為新型的非病毒基因載體材料。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)原料

第二代聚丙烯亞胺樹(shù)狀大分子 (G2.0PPI)由中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院提供 (1H NMR(CDCl3，500MHz)δ:1.33(m，4 H，NCH2CH2CH2CH2N)，1.55(m，24 H，NCH2CH2CH2N)，2.34(m，20 H，NCH2CH2CH2N)，2.39(m，16H，NCH2CH2CH2NH2)，2.67(t，16H，CH2NH2)。L－谷氨酸 (生化試劑，上海生化試劑二廠);苯甲醇、硫酸、四氫呋喃、石油醚 (30～60℃)、氯仿、乙醚 (均為分析純，廣州化學(xué)試劑廠);雙 (三氯甲基)碳酸酯 (化學(xué)純，上?；？茖W(xué)校實(shí)驗(yàn)化工廠)。

1.2 L－谷氨酸芐酯的 N－酸酐 (BLG－NCA)的制備

［12］，于三頸瓶中加入L－谷氨酸、苯甲醇、機(jī)械攪拌下滴加一定量的硫酸，加熱至70℃左右，真空脫水6 h，產(chǎn)物倒入含碳酸氫鈉的冰水中，至冰箱中過(guò)夜，抽濾，重結(jié)晶，干燥得L－谷氨酸芐酯 (BLG)。再在反應(yīng)瓶中加入新制得的BLG、四氫呋喃以及雙 (三氯甲基)碳酸酯，在50℃加熱10 min，再繼續(xù)升溫至60℃左右，待反應(yīng)液轉(zhuǎn)透明后繼續(xù)攪拌30 min。加入低沸點(diǎn)的石油醚沉淀、冷藏放置12 h后，抽濾，再用石油醚洗滌數(shù)次，真空干燥得白色結(jié)晶狀BLG－NCA。

1.3 聚丙烯亞胺－聚谷氨酸芐酯多臂接枝聚合物(Multi－armed PBLG，MP)的合成

將BLG－NCA加入到無(wú)水氯仿中，劇烈攪拌使其溶解，同時(shí)將G2.0PPI的無(wú)水氯仿溶液置三頸燒瓶中，室溫下攪拌片刻后，往燒瓶中滴加一定量的BLG－NCA的氯仿溶液，引發(fā)劑G2.0PPI與BLGNCA的摩爾比例為1∶100?；旌弦涸谑覝叵聰嚢?2 h反應(yīng)，反應(yīng)完全后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去絕大部分溶劑，加入冰乙醚沉淀，抽濾，室溫下真空干燥24 h，得白色MP固體。

1.4 表征

1.4.1 紅外光譜的測(cè)定 采用 KBr壓片制備，G2.0PPI樣品用其CHCl3液在 KBr晶片上涂膜制備，各樣品的IR譜分析在PerkinElmer 683型紅外光譜儀上進(jìn)行。

1.4.2 核磁共振測(cè)定 在 Brucker公司的 AV－600型核磁共振儀進(jìn)行1H NMR和13C NMR的測(cè)定，均以CF3COOD為溶劑，溫度為25℃。

1.4.3 GPC測(cè)定 以聚苯乙烯作為標(biāo)準(zhǔn)物，四氫呋喃為流動(dòng)相，流速為1.0 mL/min，檢測(cè)溫度為30℃，在Perkin－Elmer Series 200凝膠滲透色譜儀上進(jìn)行。

2 結(jié)果與討論

2.1 聚丙烯亞胺－聚谷氨酸芐酯多臂接枝聚合物(MP)的合成

共聚物的合成路線如圖1所示。以G2.0PPI末端的伯胺為引發(fā)劑，用開(kāi)環(huán)聚合的方法在室溫下引發(fā)BLG－NCA的聚合，即得到多臂接枝聚合物MP。

圖1 MP的合成路線Fig.1 Synthetic scheme of MP

2.2 IR 光譜分析

由圖 2可見(jiàn)，G2.0PPI的 IR圖譜中 3 346 cm－1為伯胺 N－H 的伸縮振動(dòng)，2 941、2 861和2 805 cm－1為 C－H 的伸縮振動(dòng)，1 564 cm－1為伯胺N—H的彎曲振動(dòng)，1 470、1 382和1 312 cm－1為C—H的彎曲振動(dòng)。MP的IR圖譜中1 735 cm－1峰代表生成的酯基中＝CO的伸縮振動(dòng)，而737和697 cm－1為苯環(huán)上C—H的彎曲振動(dòng)，由此圖譜可初步確定生成了聚谷氨酸芐酯的結(jié)構(gòu)。

2.3 1H NMR 的測(cè)定

圖3為以CF3COOD為溶劑的G2.0PPI、BLGNCA和MP的1H NMR譜圖，G2.0PPI在 δ 3.28和3.41(峰c和d)分別為PPI上與叔胺及伯胺相連碳上的氫，從BLG－NCA的氫譜可見(jiàn)，δ 7.2(峰i)為苯環(huán)上的氫的信號(hào)，δ 5.1(峰h)為PBLG鏈段上芐基 (—CH2Ph)上的氫，δ 4.3(峰 g)為(—CH—)上的氫，δ 2.3 ～1.8 以及 2.7 ～ 2.5(峰e(cuò)、f)分別屬于鏈接芐基和主鏈的兩組氫的信號(hào)。在MP的氫譜中g(shù)峰消失，而在δ 4.7(峰j)的位置上出現(xiàn)PBLG骨架上 (—CH—)峰，說(shuō)明開(kāi)環(huán)聚合成功。MP的氫譜中，既有G2.0PPI的峰c和d，又有PBLG側(cè)鏈上的峰e(cuò)、f、h和i。由圖譜可確定聚合物MP的生成。根據(jù)MP中苯環(huán)上的氫 (δ 7.2)和PPI上與叔胺及伯胺相連碳上的氫(δ 3.2～3.6)的積分面積之比計(jì)算出聚合物 MP中兩組分的質(zhì)量比及相對(duì)分子質(zhì)量，分別為1∶102及23 111，可見(jiàn)聚合物的實(shí)際組成與反應(yīng)的投料比接近，說(shuō)明反應(yīng)是一種可控反應(yīng)，因此可通過(guò)調(diào)節(jié)BLG－NCA單體和作為引發(fā)劑的PPI之間的摩爾比來(lái)調(diào)節(jié)聚合物的組成。

圖3 G2.0PPI、BLG－NCA和 MP的1H NMR 譜圖Fig.3 1H NMR spectra of G2.0PPI、BLG－NCA and MP

2.4 13C－NMR 的測(cè)定

從圖4中 MP的碳譜可見(jiàn)，δ 173.8和 53.5(峰7和8)分別屬于PBLG骨架上的兩種碳(—NHCO—和—CHNHCO—)。δ 69.1(峰 12)為PBLG鏈段上芐基上的碳，而δ 135.0和128.7(峰13和14)為PBLG鏈段苯環(huán)上的碳信號(hào)。δ 27.1和29.7(峰9和10)分別屬于鏈接芐基和主鏈的兩組碳的信號(hào)。從G2.0PPI的碳譜可見(jiàn)，δ 40.6是大分子引發(fā)劑G2.0PPI中 (NH2CH2—)碳上的峰(峰4)，在反應(yīng)后向高場(chǎng)移動(dòng)到δ 23.5位置，而峰1、2、3、5和6未見(jiàn)明顯移動(dòng)，說(shuō)明 G2.0PPI上所有的端氨基都作為引發(fā)劑參與了反應(yīng)，并同時(shí)引發(fā)了BLG－NCA的開(kāi)環(huán)聚合。

圖4 G2.0PPI和MP的13C NMR譜圖Fig.4 13C NMR spectra of G2.0PPI and MP

2.5 GPC 的測(cè)定

圖5為MP的GPC圖譜，曲線上的聚合物是單一峰，GPC計(jì)算所得的Mn為23 348，相對(duì)分子質(zhì)量分布為1.385，與1H NMR計(jì)算得到的相對(duì)分子質(zhì)量23 111相比，GPC測(cè)得的聚合物的相對(duì)分子質(zhì)量稍微偏大，這是由于生成的多臂聚合物材料有著與GPC標(biāo)樣聚苯乙烯不同的流體力學(xué)行為所致。

3 結(jié)論

本研究采用開(kāi)環(huán)聚合的方法，合成了 PPIPBLG多臂接枝聚合物，用 IR、1H NMR、13C NMR及GPC對(duì)共聚物進(jìn)行了表征。結(jié)果證實(shí)了生成了多臂聚谷氨酸芐酯聚合物的可行性，產(chǎn)物中無(wú)殘留反應(yīng)物。此聚合物具有樹(shù)狀大分子的對(duì)稱結(jié)構(gòu)，將為進(jìn)行下一步聚合物作為非病毒基因載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞的研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

圖5 MP的GPC譜圖Fig.5 GPC chromatogram of MP

參考文獻(xiàn):

［1］PANDITA D，SANTOS J L，RODRIGUES J，et al.Gene delivery into mesenchymal stem cells:a biomimetic approach using RGD nanoclusters based on poly(amidoamine)dendrimers［J］.Biomacromolecules，2011，12(2):472－481.

［2］LIU Y，REINEKE T M.Degradation of poly(glycoamidoamine)DNA delivery vehicles:polyamide hydrolysis at physiological conditions promotes DNA release［J］.Biomacromolecules，2010，11(2):316 －325.

［3］SMITH D K.Dendrimers and the double helix －from DNA binding towards gene therapy［J］.Curr Top Med Chem，2008，8(14):1187－1203.

［4］KLINGLER J，KAUFMANN D.Polypropylenimine generation four:a suitable vector for targeted gene alterationin vitro［J］.J Drug Target，2012，20(5):474 －480.

［5］ZINSELMEYER B H，MACKAY S P，SCHATZLEIN A G，et al.The lower－generation polypropyleneimine dendrimers are effective gene－transfer agents［J］.Pharm Res，2002，19(7):960 －967.

［6］KOPPU S，OH Y J，EDRADA－EBEL R，et al.Tumor regression after systemic administration of a novel tumortargeted gene delivery system carrying a therapeutic plasmid DNA［J］.J Control Release，2010，143(2):215 －221.

［7］RUSS V，GüNTHER M，HALAMA A，et al.Oligoethylenimine－grafted polypropylenimine dendrimers as degradable and biocompatible synthetic vectors for gene delivery［J］.J Control Release，2008，132(2):131 －140.

［8］TARATULA O，GARBUZENKO O B，KIRKPATRICK P，et al.Surface－engineered targeted PPI dendrimer for efficient intracellular and intratumoral siRNA delivery［J］.J Control Release，2009，140(3):284 －293.

［9］TOMALIA D A.Birth of a new macromolecular architecture:dendrimers as quantized building blocks for nanoscale synthetic polymer chemistry［J］.Prog Polym Sci，2005，30(3/4):294 －324.

［10］RUSS V，ELFBERG H，THOMA C，et al.Novel degradable oligoethylenimine acrylate ester－based pseudodendrimers forin vitroandin vivogene transfer［J］.Gene Ther，2008，15(1):18 －29.

［11］CHEN L，TIAN H，CHEN J，et al.Multi－armed poly(L－glutamic acid)－graft－oligoethylenimine copolymers as efficient nonviral gene delivery vectors［J］.J Gene Med，2010，12(1):64 －76.

［12］張靜夏，周永言，黃愛(ài)東.雙(三氯甲基)碳酸酯法合成L－聚谷氨酸芐酯［J］.化學(xué)試劑，2004，26(2):105－106.