郭 瓊，王 劍，姚俊華，雷玲芳，陳小潔，鄧 蕓，黃兆勝，張翠仙

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州 510006;2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510006;3.中山大學(xué)分析測試中心，廣東廣州 510275)

海洋微生物由于長期生長于高鹽、高壓、低溫和寡營養(yǎng)的特殊生境中，導(dǎo)致其產(chǎn)生結(jié)構(gòu)獨(dú)特、新穎并具有高活性、高藥效的先導(dǎo)化合物。海洋微生物不僅具有環(huán)境友好、可持續(xù)發(fā)展的特點(diǎn)，同時也是新穎結(jié)構(gòu)天然產(chǎn)物和活性天然產(chǎn)物的重要來源［1－8］。本課題組在研究海洋微生物混合共培養(yǎng)過程中細(xì)菌對真菌次生代謝產(chǎn)物的影響時，發(fā)現(xiàn)海洋珊瑚內(nèi)生細(xì)菌L－4使真菌菌落生長增快;相反內(nèi)生細(xì)菌B－2使真菌生長延遲，甚至死亡。同時通過TLC分析發(fā)現(xiàn)混合培養(yǎng)時產(chǎn)生此二者微生物單獨(dú)培養(yǎng)時所不產(chǎn)生的物質(zhì)。同時抗腫瘤活性研究表明，L－4和B－2均具有抗腫瘤活性?；诖耍瑸榱岁U明混合培養(yǎng)時可能的代謝機(jī)制和發(fā)現(xiàn)抗腫瘤活性藥物先導(dǎo)化合物，首先對L－4的次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究，初步從其發(fā)酵液中分離得到8個單體化合物，采用現(xiàn)代波譜技術(shù)和物理常數(shù)對照確定其結(jié)果依次為:環(huán) (色 －丙)二肽 (1)、環(huán) (甘 －酪)二肽 (2)、環(huán) (丙－酪)二肽 (3)、環(huán) (纈－酪)二肽 (4)、環(huán) (甘－苯丙)二肽 (5)、環(huán)(甘－脯)二肽 (6)、環(huán) (丙 －纈)二肽 (7)、和環(huán) (甘－丙)二肽 (8)。所有化合物首次從南海珊瑚內(nèi)生細(xì)菌中分離得到，且均為環(huán)二肽類化合物。

環(huán)二肽 (cyclic dipeptides)又名2，5－二氧哌嗪 (2，5－dioxopiperazines)或2，5－二酮哌嗪 (2，5－diketopiperazines)，由兩個氨基酸通過肽鍵環(huán)合形成，是自然界中最小的環(huán)肽。目前自然界中存在的環(huán)二肽一般由α－L－氨基酸形成相對穩(wěn)定的六元環(huán)。此類物質(zhì)研究表明具有抑菌、抗腫瘤、心腦血管系統(tǒng)、神經(jīng)保護(hù)及脫癮解毒方面具有重要的生理活性［9］，但能否在抗生素、抗腫瘤劑、抗凝血劑、神經(jīng)保護(hù)劑、益智劑以及脫癮劑等藥物的研發(fā)中具有一定的應(yīng)用價值，仍有待深入研究。

1 實(shí)驗部分

1.1 儀器與試劑

AVANCE AV 400核磁共振儀 (瑞士Bruker公司)，內(nèi)標(biāo)為 TMS，溶劑為氘代吡啶 (Pyr－d5);DSQ質(zhì)譜儀 (美國Thermo);制備型HPLC色譜柱(大連依利特):Kromasil 100－5－18－C18柱 (10 mm×250 mm，5 μm)，葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、蔗糖為生化試劑，購于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。石油醚、乙酸乙酯、甲醇、氯仿等為市售AR試劑。制備液相中甲醇為色譜級 (Merk公司)。

圖1 珊瑚內(nèi)生細(xì)菌L－4中的環(huán)二肽結(jié)構(gòu)1，2，3，4，5，6，7，8Fig.1 Structures of compounds 1，2，3，4，5，6，7，8 from coral－derived bacteria L － 4

實(shí)驗用微生物L(fēng)－4和B－2由海南大學(xué)提供(種屬鑒定中，樣品編號L－4，B－2保存于廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院海洋微生物實(shí)驗室)。

1.2 提取分離

內(nèi)生細(xì)菌L－4在馬鈴薯培養(yǎng)基 (馬鈴薯200 g，葡萄糖10 g，蔗糖20 g，蛋白胨2 g，人工海水100 mL，容至1 L，自然pH)中28℃下?lián)u瓶培養(yǎng)2 d，加入5 mL甲醇停止發(fā)酵，共發(fā)酵200 L。發(fā)酵液高速離心得菌絲體和上清液。上清液濃縮后依次用乙酸乙酯 (EtOAc)、正丁醇 (n－BuOH)萃取。乙酸乙酯萃取液減壓濃縮，得黃褐色浸膏(53 g)。將乙酸乙酯浸膏 (53 g)經(jīng)硅膠 (200～300目;60 g)拌樣，裝柱硅膠 (200～300目;500 g)進(jìn)行正相硅膠柱層析，采用極性逐漸增大的石油醚－乙酸乙酯體系 (V(PE)∶V(EtOAc)=10∶0、9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、1∶1、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9、0∶10)進(jìn)行洗脫，TLC 跟蹤并合并流分，共得16個流份。具體分離見分離流程圖 (圖2)。

圖2 化合物1，2，3，4，5，6，7，8分離流程圖Fig.2 Separation process of EtOAc fraction from coral－derived bacteria L － 4

1.3 化合物的物理常數(shù)和波譜數(shù)據(jù)

化合物1:淡黃色粉末，φ=10%香草醛顯色劑顯紫紅色。分子式 C14H15N3O2。ESI－MSm/z:256 ［M－H］－。1H NMR(400 MHz，Pyr－d5) δH:11.79(1H，s)，9.03(1H，br s)，8.91(1H，br s)，8.45(1H，d，8.0)，7.53(1H，d，8.0)，7.45(1H，s)，7.23(1H，q，8.0)，7.20(1H，q，7.2)，4.66(1H，m)，4.18(1H，m)，3.69(2H，m)，1.17(3H，d，6.8);13C NMR(100 MHz，Pyrd5)δC:169.8(CH)，168.9(C)，138.1(CH)，129.3(CH)，126.0(CH)，122.4(CH)，120.3(CH)，120.0(CH)，112.5(CH)，110.6(CH)，57.4(CH)，51.8(CH2)，31.7(CH2)，21.1(CH3)。

化合物2:白色粉末。碘熏顯色。分子式C11H12N2O3。ESI－MSm/z:219 ［M－H］－。1H NMR(400 MHz，Pyr－d5)δH:11.36(1H，br s)，9.26(1H，s)，8.97(1H，s)，7.38(2H，d，8.4)，7.08(2H，d，8.4)，4.57(1H，m)，3.93(1H，dd，16.8，3.2)，3.53(1H，d，16.8)，3.44(1H，dd，16.2，5.6)，3.24(1H，dd，13.5，4.2);13C NMR(100 MHz，Pyr－d5)δC:168.5(C)，166.7(C)，157.9(C)，131.9(2 × CH)，126.6(CH)，116.0(2 ×CH)，57.3(CH)，44.8(CH2)，39.8(CH2)。

化合物3:白色粉末，易溶于甲醇。碘熏顯色。分子式 C12H14N2O3。ESI－MSm/z:233 ［MH］－。1H NMR(400 MHz，Pyr－d5)δH:11.32(1H，br s)，9.10(1H，s)，9.07(1H，s)，7.40(2H，d，8.4)，7.10(2H，d，8.4)，4.60(1H，m)，4.20(1H，m)，3.51(1H，dd，16.0，5.2)，3.30(1H，dd，13.4，4.2)，1.30(3H，d，7.2);13C NMR(100 MHz，Pyr－d5)δC:169.8(C)，168.8(C)，154.5(C)，132.8(2 × CH)，129.3(CH)，115.6(2 ×CH)，60.3(CH)，54.7(CH2)，37.4(CH2)，17.0(CH3)。

化合物4:白色粉末，易溶于甲醇。碘熏顯色。分子式 C14H18N2O3。ESI－MSm/z:261 ［MH］－。1H NMR(400 MHz，Pyr－d5)δH:11.26(1H，br s)，9.05(1H，s)，9.01(1H，s)，7.38(2H，d，8.0)，7.10(2H，d，8.2)，4.60(1H，m)，4.07(1H，m)，3.49(1H，dd，16.2，5.4)，3.37(1H，dd，13.4，4.2)，2.42(1H，m)，1.12(3H，d，7.2)，0.97(3H，d，6.8);13C NMR(100 MHz，Pyr－d5)δC:169.1(C)，168.6(C)，158.9(C)，132.7(2 × CH)，128.5(CH)，117.2(2 × CH)，62.0(CH)，58.3(CH)，41.3(CH)，33.6(CH2)，20.2(CH3)，18.2(CH3)。

化合物5:白色粉末 (甲醇)。碘熏顯色。分子式 C11H12N2O2。ESI－MSm/z:203 ［M－H］－。1H NMR(400 MHz，Pyr－d5)δH:9.29(1H，s)，9.01(1H，s)，7.24 ～7.45(2H，m)，7.26 ～7.19(3H，m)，4.59(1H，m)，3.96(1H，dd，17.2，3.2)，3.50(1H，d，17.2)，3.45(1H，dd，13.2，5.6)，3.29(1H，dd，13.2，4.4);13C NMR(100 MHz，Pyr－d5)δC:168.4(C)，166.7(C)，136.9(C)，130.7(2 × CH)，128.7(CH)，127.2(2 × CH)，57.3(CH)，45.0(CH2)，40.8(CH2)。

化合物6:無色透明方型結(jié)晶 (甲醇)，θmp205～208℃。茚三酮試劑不顯色，高錳酸鉀試劑顯亮黃色斑點(diǎn)。分子式C7H10N2O2。ESI－MSm/z:153 ［M－H］－。1H NMR(400 MHz，Pyr－d5) δH:9.12(1H，s)，4.17(2H，br t，16.2)，4.09(1H，td，16.0，4.4)，3.60(1H，dt，8.2，3.2，11.2)，3.45(1H，td，10.0，3.2)，2.26(1H，m)，2.09(1H，m)，1.68(1H，m)，1.62(1H，m);13C NMR(100 MHz，Pyr－d5)δC:171.3(C)，165.6(C)，60.2(CH)，48.2(CH2)，46.6(CH2)，30.11(CH2)，23.8(CH2)。

化合物7:白色粉末，易溶于甲醇。TLC呈:254 nm下無暗斑，香草醛濃硫酸不顯色，茚三酮顯色陰性。分子式 C8H14N2O2。ESI－MSm/z:169［M－H］－。1H NMR(400 MHz，Pyr－d5)δH:9.18(1H，s)，8.90(1H，s)，4.34(1H，q，6.4)，4.15(1H，m，)，2.65(1H，m)，1.68(3H，d，7.2)，1.16(3H，d，6.8)，1.11(3H，d，6.8);13C NMR(100MHz，Pyr－d5)δC:169.7(C)，167.8(C)，60.9(CH)，51.1(CH)，32.1(CH)，21.0(CH3)，19.1(CH3)，17.0(CH3)。

化合物8:白色粉末，茚三酮顯色陰性。分子式 C5H8N2O2。ESI－MSm/z:127 ［M－H］－。1H NMR(400 MHz，Pyr－d5)δH:9.27(1H，s)，9.06(1H，s)，4.25(1H，q，6.8，)，4.24(2H，br s)，1.62(3H，d，7.8)。13C NMR(100 MHz，Pyr－d5)δC:170.8(C)，168.1(C)，51.9(CH)，46.7(CH2)，20.3(CH3)。

2 結(jié)果與討論

化合物1淡黃色粉末，φ=10%香草醛顯色劑顯紫紅色。1H NMR 中 δH9.03(1H，br s)和 8.91(1H，br s)為氨基上的活潑氫信號，同時13C NMR譜中δC169.8(s)，168.9(s)為兩個酰胺羰基碳信號，δH4.66(1H，m)和4.18(1H，m)為氮雜環(huán)中叔碳上的質(zhì)子信號，推測1可能為環(huán)二肽類化合物。其中 δH11.79(1H，br s)、8.45(1H，d，8.0)、7.53(1H，d，8.0)、7.45(1H，s)、7.23(1H，q，8.0)、7.20(1H，q，7.2)、δH4.66(1H，m)及3.69(2H，m)推斷結(jié)構(gòu)中有色氨酸片段，結(jié)合 δH4.18(1H，m)及1.17(3H，d，6.8)推斷可能有丙氨酸片段。將化合物1的NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn) ［10－11］環(huán) (色－丙)二肽對照，基本一致，確定1為環(huán) (色－丙)二肽 (cyclo(Trp－Ala))。

化合物2白色粉末，碘熏顯色。1H NMR中:δH9.26(1H，s)和8.97(1H，s)為2個氨基上的氫信號;同時13C NMR 中 δC168.5(s)，166.7(s)為兩個酰胺羰基碳信號，說明該化合物可能是一個環(huán)二肽類物質(zhì)。δH7.38(2H，d，8.4)和 7.08(2H，d，8.4)為典型對位取代芳環(huán)上的質(zhì)子信號，以及 δC157.9(s)、131.9(d)、126.6(s)、116.0(d)信號與酪氨酸的碳信號接近，同時δH3.44(1H，dd，16.2，5.6)和 3.24(1H，dd，13.5，4.2)為1個亞甲基上的2個質(zhì)子信號，且這2個質(zhì)子信號化學(xué)環(huán)境不同，結(jié)合δH4.57(1H，m)及δC57.3(d)、44.8(d)，可推斷該化合物含酪氨酸殘基。δH3.93(1H，dd，16.8，3.2)、3.53(1H，d，16.8)和 δC166.7(s)、39.8(t)提示該化合物含甘氨酸殘基，由于有芳環(huán)支鏈的環(huán)二肽可能存在折疊構(gòu)象［12］，折疊構(gòu)象使甘氨酸片段的亞甲基質(zhì)子受苯環(huán)的屏蔽影響，化學(xué)位移向高場偏移。將化合物2的NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn) ［13］環(huán) (甘－酪)二肽對照，基本一致，確定2為環(huán) (甘－酪)二肽 (cyclo(Gly－Tyr))。

化合物3，白色粉末，碘熏顯色。1H NMR譜中:δH9.10(1H，s)和9.07(1H，s)為2個氨基上的氫信號;同時13C NMR譜中 δC169.8(s)，168.8(s)為兩個酰胺羰基碳信號，說明為環(huán)二肽類物質(zhì)。δH7.40(2H，d，8.4)和7.10(2H，d，8.4)為典型對位取代芳環(huán)上的質(zhì)子信號，以及δC154.5(s)、132.8(s)、129.3(s)、115.6(s)信號與酪氨酸的碳信號接近，同時δH3.51(1H，dd，16.0，5.2)和3.30(1H，dd，13.4，4.2)為1個亞甲基上的2個質(zhì)子信號，且這2個質(zhì)子信號化學(xué)環(huán)境不同，結(jié)合 δH4.60(1H，m)及 δC60.3(d)、37.4(d)，可推斷該化合物含苯丙氨酸殘基。δH4.20(1H，m)和 1.30(3 H，d，7.2)及δC54.7(d)、20.3(q，C －3)暗示結(jié)構(gòu)中存在丙氨酸殘基。將其 NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn) ［14－15］環(huán)(丙－酪)二肽對照，基本一致，確定3為環(huán) (丙－酪)二肽 (cyclo(Ala－Tyr))。

化合物4，白色粉末，易溶于甲醇。1H NMR中:δH9.05(1H，s)和9.01(1H，s)為2個氨基上的氫信號;同時13C NMR中δC169.1(s)，168.9(s)為兩個酰胺羰基碳信號，說明其為環(huán)二肽類物質(zhì)。δH7.38(2H，d，8.04)和 7.10(2H，d，8.2)為典型對位取代芳環(huán)上的質(zhì)子信號，以及δC158.9(s)、132.7(d)、128.5(s)、117.2(d)信號與酪氨酸殘基信號相似，同時δH3.49(1H，dd，16.2，5.4)和 3.37(1H，dd，13.4，4.2)為 1 個亞甲基上的2個質(zhì)子信號，且此二質(zhì)子信號化學(xué)環(huán)境不同，結(jié)合 δH4.60(1H，m)及 δC58.3(d)、41.3(d)，可推斷該化合物含苯丙氨酸殘基。δH2.42(1H，m)、1.12(3H，d，7.2)、0.97(3H，d，6.8)顯示結(jié)構(gòu)中含異丙基片段，結(jié)合δH4.07(1H，m)說明結(jié)構(gòu)中含纈氨酸殘基。將其NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn) ［16－17］環(huán) (纈－酪)二肽對照，基本一致，確定4為環(huán) (纈－酪)二肽(cyclo(Val－Tyr))。

化合物5，白色粉末，碘熏顯色。1H NMR中:δH9.29(1H，s)和9.01(1H，s)為2個氨基上氫信號，13C NMR 中 δC168.4(s)，166.7(s)為兩個酰胺羰基碳信號，說明該化合物亦為環(huán)二肽類化合物。δH7.24 ～ 7.45(2H，m)，7.26 ～ 7.19(3H，m)為典型單取代芳環(huán)上的質(zhì)子信號，同時δC168.4(s)，136.9(s)，130.7(d，2C)，128.7(d，2C)，127.2(d)碳信號與苯丙氨酸的碳信號接近，δH3.45(1H，dd，13.2，5.6)及3.29(1H，dd，13.2，4.4)為1個亞甲基上的2個質(zhì)子信號，且這2個質(zhì)子信號化學(xué)環(huán)境不同，結(jié)合 δH4.59(1H，m)及δC57.3(d)，40.8(t)可推斷化合物含苯丙氨酸殘基;δH3.96(1H，dd，17.2，3.2)、3.50(1H，d，17.2)和 δC166.7(s)，45.0(d)，提示該化合物含甘氨酸殘基。將化合物5的NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn) ［18－19］環(huán) (甘－苯丙)對照，基本一致，確定5為環(huán) (甘 －苯丙)二肽 (cyclo(Gly－Phe))。

化合物6，無色透明方型結(jié)晶，θmp205～208℃。茚三酮試劑不顯色，高錳酸鉀試劑顯亮黃色斑點(diǎn)。ESI－MSm/z153 ［M－H］－提示相對分子質(zhì)量為154。1HNMR 譜中:δH9.12(1H，brs)為甘氨酸活潑氨基氫信號 (N－H)，δH3.60(1H，dt，8.2，3.2，11.2)、3.45(1H，td，10.0，3.2)、2.26(m，1H)、2.09(1H，m)、1.68(1H，m)、1.62(1H，m)和 δC171.3(s)、60.2(d)、46.6(t)、30.1(t)、23.9(t)為脯氨酸殘基信號，δH4.09(1H，td，16.0，4.4)和4.17(2H，br t，16.2)及δC165.6(s)和48.2(t)暗示結(jié)構(gòu)中有甘氨酸片斷。將化合物6的NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)環(huán) (甘－脯)二肽對照［19－21］，基本一致，確定 6為環(huán) (甘 －脯)二肽 (cyclo(Gly－Pro))。

化合物7，白色粉末，香草醛濃硫酸不顯色，茚三酮顯色陰性。1H NMR中 δH9.18(1H，s)和8.90(1H，s)為兩個氨基活波氫信號，δH2.65(1H，m)、1.16(3H，d，6.80)、1.11(3H，d，6.80)顯示結(jié)構(gòu)中含異丙基片段，結(jié)合 δH4.15(1H，dd，6.80，13.50)說明結(jié)構(gòu)中含纈氨酸殘基。δH4.34(1H，q，6.4)和 1.68(3H，d，7.2)顯示結(jié)構(gòu)中含丙氨酸殘基。將化合物7的NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn) ［19，22－23］環(huán) (丙－纈)二肽對照，基本一致，確定7為環(huán) (丙 －纈)二肽 (cyclo(Ala－Val))。

化合物8，白色粉末，茚三酮顯色陰性，薄層原位酸水解后茚三酮顯色陽性，提示為環(huán)肽類成分。ESI－MSm/z127［M－H］－提示相對分子質(zhì)量為128。1H NMR δH9.27(1H，s)，9.06(1H，s)說明存在活波的氨基質(zhì)子信息;δH4.00(1H，q，6.8)和1.62(3 H，d，6.6)及 δC51.93(d)、20.26(q)暗示結(jié)構(gòu)中存在丙氨酸殘基。δH3.91(2H，br s)和13C NMR中δC46.7(t)暗示存在甘氨酸殘基。將其NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn) ［24－25］環(huán) (甘 －丙)二肽對照，基本一致，確定8為環(huán) (甘－丙)二肽 (cyclo(Gly－Ala))。

致謝:感謝廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院2009級本科生蔡劍雄、梁敏、李玉婷、張海霞、曾婷在微生物實(shí)驗中的幫助;感謝中山大學(xué)分析測試中心關(guān)山越老師的測試支持。

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