李春燕，陸 羽，陳 燁，鄭嘉雯，王 軍

(中山大學(xué)藥學(xué)院，廣東廣州 510006)

蘭科石斛屬Dendrobium SW.植物全世界約有1 100種，我國境內(nèi)有76種，其中有近40種被作為藥用［1］，用于治療胃陰不足，病后虛熱不退，目暗不明等癥［2］。在治療糖尿病及老年性疾病的方劑中，石斛常是主要成分［3－5］。由于石斛的藥效及廣泛用途，成為藥用植物的研究熱點，得到國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注［6］。

環(huán)草石斛也叫小環(huán)釵石斛、美花石斛、粉花石斛，主要分布于貴州、廣西、云南和廣東等省，被2000版中國藥典收載。因金釵石斛，鐵皮石斛等價格昂貴，中醫(yī)臨床所使用的石斛多是環(huán)草石斛或黃草石斛。關(guān)于環(huán)草石斛的化學(xué)成分研究較少，李滿飛等［7］從環(huán)草石斛的HCl(φ=1%)浸提液中分離到了有抑制大鼠腎臟微粒體活性的石斛寧生物堿;秦海林等［8］部分歸屬了環(huán)草石斛特征性標(biāo)準(zhǔn)提取物 (SCE)乙醚萃取部位的1H NMR指紋圖譜;Ito等［9］研究了環(huán)草石斛φ=80%醇提液的化學(xué)組成，找到了具清除自由基活性及NO生成抑制活性的新結(jié)構(gòu)芪類。

我們在研究中藥藥效成分的工作中發(fā)現(xiàn)，約有50%的環(huán)草石斛醇取物分配在大極性的正丁醇萃取部位，而已報道的關(guān)于環(huán)草石斛化學(xué)成分的研究大都集中在石油醚、乙酸乙酯等中小極性萃取部位。為了闡明環(huán)草石斛的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，本研究對環(huán)草石斛甲醇提取液進行了系統(tǒng)的化學(xué)成分研究，利用現(xiàn)代色譜技術(shù)和波譜技術(shù)分離鑒定了7個化合物，分別是:石斛寧 (1)，2，4，7－三羥基－9，10－二氫菲 (2)，moscatin(3)，loddigesiinols C(4)，杓唇石斛酚 (5)，石斛酚 (6)，tristin(7)，其結(jié)構(gòu)見圖1。其中化合物2和7為首次在環(huán)草石斛中分離得到，對環(huán)草石斛的藥效成分進行了初步探討。

圖1 分自環(huán)草石斛的化合物分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of compounds from Dendrobium loddigesii

1 材料與方法

1.1 實驗試劑與儀器

實驗試劑:石油醚、乙酸乙酯、甲醇、二氯甲烷、丙酮等為分析純試劑，氘代試劑為美國CIL產(chǎn)品;TLC硅膠 (GF254)和柱層析硅膠 (200～300目)均為青島海洋化工有限公司產(chǎn)品，Sephadex LH－20凝膠為美國GE Healthcare產(chǎn)品，反相硅膠ODS－A為日本Daiso公司產(chǎn)品。環(huán)草石斛 (莖)D.loddigesiiRolfe于2011年9月購自廣州采芝林藥店，該藥材產(chǎn)自云南，廣州市藥材公司中藥飲片廠監(jiān)制，由中山大學(xué)藥學(xué)院蔣林研究員鑒定。

實驗儀器:日本島津LC－20AT中壓液相制備色譜，Bruker AvanceШ 400 MHz核磁共振譜儀，LCQ DECA XP型液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Perkin Eimer TM公司Perkin Eimer 341型比旋光測定儀。

1.2 提取與分離

環(huán)草石斛 (莖)4 kg，甲醇冷浸 (35 L ×2)，減壓濃縮提取液得浸膏100 g。將浸膏懸浮于水中，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯及正丁醇萃取 (3 L×3)，減壓濃縮萃取液，分別得石油醚萃取浸膏13 g，氯仿萃取浸膏25 g，乙酸乙酯萃取浸膏10 g，正丁醇萃取浸膏47 g，水溶層浸膏16 g。

氯仿萃取浸膏經(jīng)Sephadex LH－20凝膠柱層析，甲醇洗脫，脫去葉綠素后，用硅膠 (200～300目)柱色譜分離，以石油醚－乙酸乙酯 (體積比為 100∶0、90∶1 、80∶20 、70∶30 、50∶50、40∶60、10∶90和0∶100)混合溶劑梯度洗脫，得到8個餾分 (Fr.L1～8)。Fr.L5～6合并 (6 g)，經(jīng)中壓液相色譜系統(tǒng)分離，固定相為ODS反相鍵合硅膠，水－甲醇混合溶劑梯度洗脫，分段收集，在V(水)∶V(甲醇)=50∶50段得化合物 5，V(水)∶V(甲醇)=45∶55段分別得化合物6、化合物4，V(水)∶V(甲醇)=40∶60段得化合物3，各餾份分別進一步經(jīng)Sephadex LH－20凝膠柱色譜純化，甲醇洗脫，得到相應(yīng)的純化合物。Fr.L 7與乙酸乙酯萃取部位合并，用硅膠 (200～300目)柱色譜分離，以石油醚－乙酸乙酯 (體積比為100∶0、90∶1 、80∶20，70∶30 、50∶50、30∶70、20∶80和0∶100)混合溶劑梯度洗脫，得到8個餾分 (Fr.Y1～8)。Fr.Y6～7合并(3 g)，經(jīng)中壓液相色譜系統(tǒng)純化，固定相為ODS反相鍵合硅膠，以水－甲醇混合溶劑梯度洗脫，收集V(水)∶V(甲醇)=70∶30段餾份，得化合物2，繼續(xù)收集V(水)∶V(甲醇)=60∶40段餾份得化合物7，各段餾份分別再經(jīng)Sephadex LH－20凝膠柱色譜多次純化，甲醇洗脫，得相應(yīng)的純化合物。正丁醇萃取浸膏，經(jīng)Sephadex LH－20凝膠柱色譜除糖，甲醇洗脫，再經(jīng)正相硅膠柱色譜分離，V(二氯甲烷)∶V(甲醇)=25∶1混合溶劑等度洗脫，得到化合物1。

2 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1，淡黃色油狀液體，易溶于乙酸乙酯、甲醇等。ESI－MSm/z:204.3［M+H］，分子式 C12H13NO2，不飽和度為 7。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ:7.87(1H，d，7.2 Hz)，7.71(1H，t，7.2 Hz)，7.57(1H，t，7.2 Hz)，7.47(1H，d，7.2 Hz)，3.39(1H，m)，3.07(1H，m)，2.46(1H，m)，2.38(1H，m)，2.14(2H，m)，2.13(3H，s)，與文獻 ［10］對照，鑒定化合物1為石斛寧。

化合物2，白色片狀結(jié)晶，易溶于丙酮。ESI－MSm/z:227.3［M－H］，分子式C14H12O3，不飽和度為 9。1H NMR(400 MHz，aceton－d6)δ:8.25(1H，d，8 Hz)，6.74(1H，dd，1.2，8 Hz)，6.73(1H，d，1.2 Hz)，6.44(1H，d，1.2 Hz)，6.34(1H，d，1.2 Hz)，2.63(4H，s)，與文獻［11］對照，鑒定化合物2為2，4，7－三羥基－9，10－二氫菲。

化合物3，白色粉末狀結(jié)晶，易溶于丙酮。ESI-MSm/z:239.2［M －H］，分子式 C15H12O3，不飽和度為 10。1H NMR(400 MHz，aceton-d6)δ:7.63(1H，d，8.8 Hz)，7.50(1H，d，8.8 Hz)，7.44(1H，t，8.8 Hz)，7.40(1H，dd，8.8，1.6 Hz)，7.14(1H，dd，8.8，1.6 Hz)，7.10(1H，d，1.6 Hz)，7.02(1H，d，1.6 Hz)，4.15(3H，s)。與文獻 ［12］對照，鑒定化合物3為moscatin。

化合物4，無定形白色固體，易溶于氯仿、丙酮、甲醇等。ESI-MSm/z:333.1［M－H］，分子式C18H22O6，不飽和度為8。 ［α］27D－0.6°(c=1.0，MeOH)。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ:6.78(1H，d，7.8 Hz)，6.59(1H，dd，7.8，1.5 Hz)，6.49(1H，d，1.5 Hz)，6.41(2H，s)，4.17(1H，t，6.6 Hz)，3.82(6H，s)，3.76(3H，s)，3.20(3H，s)，3.02(1H，dd，6.9，13.3 Hz)，2.76(1H，dd，6，13.6 Hz)。與文獻 ［9］對照，鑒定化合物4為loddigesiinols C。

化合物5，白色針狀結(jié)晶，易溶于氯仿、丙酮、甲醇等。ESI-MSm/z:305.1［M+H］，分子式C17H20O5，不 飽 和 度 為 8。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ:6.81(1H，d，8 Hz)，6.66(1H，dd，1.6，8 Hz)，6.59(1H，dd，1.6 Hz)，6.34(2H，s)，3.82(6H，s)，3.81(3H，s)，2.79(4H，s)。與文獻［8］對照，鑒定化合物5為杓唇石斛酚。

化合物6，淡黃色油狀物，易溶于氯仿、丙酮、甲醇等。ESI-MSm/z:273.2［M－H］，分子式 C16H18O4，不飽和度為 8。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ:6.81(1H，d，8 Hz)，6.65(1H，dd，8，1.6 Hz)，6.60(1H，d，1.6 Hz)，6.29(1H，d，1.6 Hz)，6.23(2H，d，1.6 Hz)，3.82(3H，s)，3.72(3H，s)，2.78(4H，s)。與文獻 ［8］對照，鑒定化合物6為gigantol。

化合物7，無色針狀結(jié)晶，易溶于丙酮。ESIMSm/z:259.2［M－H］，分子式C15H16O4，不飽和度為 8。1H NMR(400 MHz，aceton-d6)δ:6.79(1H，d，1.6 Hz)，6.70(1H，d，8 Hz)，6.61(1H，dd，1.6，8 Hz)，6.21(2H，d，1.6 Hz)，6.19(1H，d，1.6 Hz)，3.79(3H，s)，2.75(4H，m)。與文獻［13］對照，鑒定化合物7為tristin。

3 結(jié)果與討論

研究對環(huán)草石斛的甲醇提取物進行了較系統(tǒng)的分離，單離到6個多酚和1個生物堿 (化合物結(jié)構(gòu)式見圖1)，化合物1，2，3，4，5，6，7(w/%)分 別 為 0.062，0.010，0.001，0.001，0.025，0.001，0.003，其中化合物2和7為首次在環(huán)草石斛中發(fā)現(xiàn)的芪類化合物。

本研究從環(huán)草石斛的正丁醇萃取部位單離到大量的石斛寧生物堿，從4 kg藥材中分到2.5 g多純品 (純度為99%);進一步用1H NMR技術(shù)研究環(huán)草石斛正丁醇萃取物，結(jié)果顯示，低場δ 8.5～7.5有強的石斛寧及類似結(jié)構(gòu)化合物的共振信號 (見圖2)，可推出石斛寧或類似結(jié)構(gòu)的生物堿為環(huán)草石斛的主要化學(xué)成分，故環(huán)草石斛屬含生物堿較多的優(yōu)質(zhì)石斛藥材［14］;環(huán)草石斛中等極性部位的化學(xué)成份主要是聯(lián)芐、9，10－二氫菲、菲等多酚類物質(zhì)，5在其中含量最多，其次是化合物2。

圖2 環(huán)草石斛正丁醇萃取部位1H NMR譜(400 MHz，Methanol-d4)Fig.2 1H NMR spectrum of the extract from Dendrobium loddigesii with n-BuOH

石斛寧目前只在蘭科植物中發(fā)現(xiàn)，對蘭科植物的化學(xué)分類學(xué)有重要意義［15］。已有研究報道石斛寧能抑制大鼠腎臟微粒體Na-K-ATP酶［8］，這一藥理活性與石斛在中醫(yī)臨床上滋陰清熱的功效是相吻合的，因此石斛寧可被認(rèn)為是石斛滋陰清熱的藥效成分之一。芪類化合物具有廣泛的抗血小板聚集、抗炎、抗腫瘤、抗畸變、抗氧化、細(xì)胞凋亡等活性［16－18］，這些結(jié)構(gòu)多樣性的芪類化合物，與中醫(yī)認(rèn)為石斛具有抗衰老功效相吻合。

4 結(jié)論

本研究得出環(huán)草石斛中生物堿和芪類化合物的含量非常豐富，且有較多的結(jié)構(gòu)多樣性。深入研究環(huán)草石斛的活性成分，可為闡明其成份－藥效的關(guān)系提供科學(xué)依據(jù)，也可為石斛所制成的中成藥質(zhì)量控制提供依據(jù)。

［1］武榮，栗燕.石斛資源保護研究進展［J］.河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，12:9 －15.

［2］國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典(第一部)［M］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社.2010.

［3］林雅，余文珍，鄭燕芳，等.石斛合劑對糖尿病大鼠模型血糖血脂代謝的影響［J］.福建中醫(yī)藥大學(xué)，2012，22(3):22－25.

［4］李長征，余文珍，蔣藝燕，等.石斛合劑對糖尿病大鼠腎臟的保護作用［J］.福建中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2012，22(3):18－23.

［5］黃江麗.石斛夜光丸合復(fù)方血栓通膠囊治療中心性漿液性脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜病變［J］.光明中醫(yī)，2008，23(12):1934－1937.

［6］明興加，伍淳操，鐘國躍，等.中國石斛屬植物文獻計量研究［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2010，16(14):221－226.

［7］李滿飛，甘平，田羲正.粉花石斛化學(xué)成分研究［J］.藥學(xué)學(xué)報，1991，26(4):307 －310.

［8］秦海林，張建新，郝小江，等.環(huán)草石斛的1H-NMR指紋圖譜解析［J］.中國中藥雜志，2002，27(12):919－924.

［9］ITO M，MATSUZAKI K，WANG J，et al.New phenanthrenes and stilbenes fromDendrobium loddigesii［J］.Chem Pharm Bull，2010，58(5):628 －633.

［10］KAWANISHI K，UHARA Y，HASHIMOTO Y.Shihunine and dihydroshihunine fromBanisteriopsis caapi［J］.J Nat Prod，1982，45(5):637－639.

［11］張朝鳳，邵莉，黃衛(wèi)華，等.兜唇石斛酚類化學(xué)成分研究［J］.中國中藥雜志，2008，33(24):2922－2925.

［12］李玉鵬，蔣金和，劉瑩，等.金釵石斛化學(xué)成分的研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2010，21(1):39 －42

［13］張婷，張朝鳳，王崢濤，等.翅梗石斛的化學(xué)成分研究［J］.中國天然藥物，2005，3(1):28－32.

［14］魏小勇.石斛屬植物生物堿研究進展［J］.中國藥事，2005，19(7):445 －447.

［15］BASTIDA J，SELLES M，CODINA C，et al.Alkaloids fromBehria tenuiflora［J］.Planta Medica，1996，62(6):575－577.

［16］TSAI A C，PAN S L，LIAO C H，et al.Moscatilin，a bibenzyl derivative from the Indiaorchid Dendrobrium loddigesii，suppresses tumor angiogenesis and growth in vitro andin vivo［J］.Cancer Letters，2010，292:163 －170.

［17］MIYAZAWA M，SHIMAMURA H，NAKAMURA S，et al.Moscatilin fromDendrobium nobile，a naturally occurring bibenzyl compound with potential antimutagenic activity［J］.J Agric Food Chem，1999，47:2163 －2167.

［18］CHEN T H，PAN S L，GUH J H，et al.Moscatilin induces apoptosis in human colorectal cancer cells:A crucial role of c-Jun NH 2－terminal protein kinase activation caused by tubulin depolymerization and DNA damage［J］.Clin Cancer Res，2008，14:4250 －4258.