肖紅梅 肖旭 劉志紅 李金泉

DBY（DDX3Y，DEAD box on the Y）基因是精子發(fā)生中起關(guān)鍵性作用的基因之一，在動(dòng)物繁殖育種中起著重要作用［1，2］。它位于哺乳動(dòng)物Y染色體的AZFa區(qū)［3，4］，是AZFa區(qū)最主要的候選基因。編碼一個(gè)ATP依賴(lài)性RNA解螺旋酶，屬于DEAD（天冬氨酸-谷氨酸-丙氨酸-天冬氨酸序列）盒蛋白家族的成員，參與細(xì)胞的各種過(guò)程，包括剪接，核糖體合成和RNA降解等［5］。人的DBY基因位于USP9Y基因下游45 kb處，含有17個(gè)外顯子，其編碼的mRNA在睪丸組織中特異表達(dá)，主要見(jiàn)于精子和粗線(xiàn)期的精母細(xì)胞中，DBY的缺失可導(dǎo)致生精細(xì)胞的嚴(yán)重減少甚至完全缺乏，顯示的病理性表型為生精細(xì)胞生長(zhǎng)障礙，而且在AZFa區(qū)中DBY的缺失率比 USP9Y 高［6-8］。Kleiman等［9］通過(guò)無(wú)精癥患者組織檢查發(fā)現(xiàn)：精子發(fā)生障礙時(shí)，DBY基因轉(zhuǎn)錄物表達(dá)不足。因此，DBY基因微缺失在AZFa區(qū)缺失類(lèi)型中極具代表性。Foresta等［8］在對(duì)精子生成障礙患者進(jìn)行睪丸活檢時(shí)發(fā)現(xiàn)，DBY缺失的患者表現(xiàn)為I型唯支持細(xì)胞綜合征和小睪丸癥，即僅有支持細(xì)胞而無(wú)精原細(xì)胞。同時(shí)在對(duì)小鼠體的同源基因DBY研究也同樣發(fā)現(xiàn)，DBY的缺失導(dǎo)致小鼠精子發(fā)生障礙［10，11］，證明了DBY對(duì)睪丸精子發(fā)生的重要作用。

但迄今為止，DBY基因在生殖細(xì)胞發(fā)育中的具體作用還不清楚。為此，國(guó)內(nèi)外的一些專(zhuān)家對(duì)哺乳動(dòng)物DBY基因進(jìn)行了研究，但由于Y染色體結(jié)構(gòu)復(fù)雜，存在大量的重復(fù)序列，難于組裝，所以研究的物種很少，大量集中于對(duì)人的研究，而對(duì)絨山羊的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本試驗(yàn)對(duì)絨山羊Y染色體DBY基因進(jìn)行了篩選與測(cè)序，旨在為進(jìn)一步研究DBY基因在絨山羊Y染色體上的定位、分析其在精子發(fā)生中的作用機(jī)理以及基因進(jìn)化提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

絨山羊BAC文庫(kù)由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物遺傳育種實(shí)驗(yàn)室提供，血液采集于鄂爾多斯羊場(chǎng)隨機(jī)選取的10頭絨山羊（5公，5母）的頸靜脈血。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的制備 選100-120μL抗凝血加雙蒸水至1.5mL，充分混勻，冰浴10min后12000r/min離心1min，棄上清，向下層沉淀中加100μL

雙蒸水使之充分懸浮，煮沸10min，立即冰浴5min，以12000r/min離心5min，取上清于另一個(gè)離心管即可用于PCR檢測(cè)，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 以GenBank收錄的牛的DBY序列為模板，應(yīng)用軟件Primer設(shè)計(jì)引物并由上海生物工程有限公司合成。上游引物序列：5'-tcatctgttggaacttttc-3'；下游引物序列：5'-atctccttggttttagcc-3'。

1.2.3 PCR擴(kuò)增條件 以建庫(kù)的內(nèi)蒙古絨山羊基因組為模板，通過(guò)正交拉丁設(shè)計(jì)方法確定DBY基因最佳的20μL PCR反應(yīng)體系為：上下游引物（10 pmol/μL）各為0.5μL，絨山羊基因組DNA模板（30ng/μL）1.1μL，10×buffer 2μL，dNTP 2.1μL，Taq DNA 聚合酶 0.3μL，超純水13.5μL。PCR 反應(yīng)循環(huán)程序：94℃預(yù)變性5min；94℃變性45s，58℃退火45s，72℃延伸 45s，32個(gè)循環(huán)；72℃延伸 5min，4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.4 超級(jí)池的篩選 根據(jù)已確定的擴(kuò)增條件，以絨山羊基因組BAC文庫(kù)的超級(jí)池DNA為模板，加一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照（以已擴(kuò)增出的基因組為模板）、一個(gè)陰性對(duì)照（以滅菌超純水為模板）和一個(gè)絨山羊的雌性基因組對(duì)照，進(jìn)行PCR反應(yīng)，用1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，篩出DBY基因所在的二級(jí)池編號(hào)。

1.2.5 二級(jí)池篩選 以超級(jí)池篩選出的陽(yáng)性二級(jí)池DNA為模板，通過(guò)PCR反應(yīng)（反應(yīng)條件同篩選陽(yáng)性超級(jí)池的條件）篩選DBY基因所在的板池、行池、列池，并加陰陽(yáng)性對(duì)照。PCR產(chǎn)物用1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，獲得二級(jí)池的板池、行池、列池的陽(yáng)性克隆編號(hào)。

1.2.6 陽(yáng)性克隆、測(cè)序 依照二級(jí)池的PCR篩選結(jié)果，確定DBY基因陽(yáng)性克隆在BAC文庫(kù)中的位置，從-80℃冰箱中取出凍存的菌樣，挑取文庫(kù)中的目的菌落，在含有氯霉素（12.5μg/mL）的 LB平板上劃線(xiàn)，37℃恒溫培養(yǎng)，得到包含DBY基因的陽(yáng)性單克隆并鑒定。然后把PCR產(chǎn)物純化、回收，連接到T載體上，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，通過(guò)藍(lán)白斑篩選，將陽(yáng)性克隆進(jìn)行劃線(xiàn)培養(yǎng)并進(jìn)行菌體PCR陽(yáng)性檢測(cè)。對(duì)檢測(cè)得到的陽(yáng)性克隆菌液培養(yǎng)過(guò)夜，將菌液送交上海生工進(jìn)行測(cè)序。

1.2.7 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建 利用Mega5軟件，根據(jù)與山羊同源物種的DBY基因序列建立物種間的NJ系統(tǒng)樹(shù)（Neighbour-joining tree），進(jìn)行進(jìn)化分析。

2 結(jié)果

2.1 超級(jí)池篩選

以稀釋10倍的超級(jí)池DNA為模板54℃擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5％瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè)，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察PCR 擴(kuò)增情況，結(jié)果如圖1所示。從凝膠電泳圖可以看出，通過(guò)PCR 擴(kuò)增得到陽(yáng)性二級(jí)池有兩個(gè)，分別為S21（泳道5）和S24（泳道8），經(jīng)過(guò)多次檢驗(yàn)，最終確定S21為所需條帶。其條帶單一而且明亮并與雌性對(duì)照條帶大小不同。擴(kuò)增的片段大小為240bp左右。

2.2 二級(jí)池篩選

將陽(yáng)性二級(jí)池S21稀釋10倍后，取4μL做PCR模板，擴(kuò)增二級(jí)池。PCR反應(yīng)條件同超級(jí)池。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5％瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示。

圖1 DBY超級(jí)池篩選

圖2 DBY二級(jí)池篩選

根據(jù)S21池行、列、板池的定位結(jié)果，得到DBY基因在基因組BAC文庫(kù)中的位置為行池D、4列池3、6列池6、板池5，定位于405D22。

2.3 菌體PCR鑒定

從文庫(kù)中找到405D22的陽(yáng)性克隆，在1mL的LB培養(yǎng)基（加有氯霉素12.5μg/mL）中，37℃恒溫培養(yǎng)24h，之后做菌體PCR鑒定。為得到更好的克隆結(jié)果排除假陽(yáng)性，菌落PCR時(shí)，做了3個(gè)平行的菌落，結(jié)果（圖3）顯示，所得到的菌體PCR產(chǎn)物條帶很清晰，且與目的條帶大小一致，可鑒定出獲得的單克隆為陽(yáng)性。然后選取條帶最清晰的菌，進(jìn)行后續(xù)的膠回收工作。

圖3 DBY菌體PCR鑒定

2.4 PCR產(chǎn)物回收、菌體重組質(zhì)粒鑒定

將菌體PCR產(chǎn)物（圖4）切膠回收、純化后，用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)DNA純度，OD值（A260/A280）為1.87，膠回收效果較好，可用于亞克隆鑒定。

圖4 膠回收電泳檢測(cè)

2.5 克隆鑒定

將回收的菌體PCR產(chǎn)物用pEASY-T1載體連接，轉(zhuǎn)化后，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，挑取單克隆劃線(xiàn)，做菌體PCR鑒定陽(yáng)性克隆，結(jié)果如圖5所示，菌體PCR產(chǎn)物條帶與目的基因條帶一致，清晰可見(jiàn)，說(shuō)明轉(zhuǎn)化成功，可用于亞克隆測(cè)序。

圖5 DBY克隆鑒定

2.6 DBY克隆測(cè)序

經(jīng)序列測(cè)序，得到引物擴(kuò)增基因組產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為240bp，序列堿基組成如圖6所示。該序列中A+T和G+C含量分別為70％和30％，A+T的含量相對(duì)較高。與GenBank收錄的其他物種序列進(jìn)行比對(duì)：與綿羊DBY基因的同源性為96％；與坡鹿、水牛的同源性達(dá)93％；與豬鹿、瘤牛和牛的同源性分別達(dá)92％和91％；而與人和黑猩猩及小鼠的序列無(wú)同源性。此片段長(zhǎng)為240bp，包括長(zhǎng)為186bp的內(nèi)含子和54bp的外顯子，共編碼52個(gè)氨基酸。篩選出的BAC為Y染色體基因組片段。

圖6 DBY堿基序列

2.7 進(jìn)化分析

從構(gòu)建的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖7）可看出，首先山羊和綿羊、野牛和瘤牛的親緣關(guān)系最近，分別屬于哺乳動(dòng)物偶蹄目、?？蒲騺喛坪团喛疲黄浯问翘﹪?guó)坡鹿和緬甸坡鹿的親緣關(guān)系較近，屬于偶蹄目的鹿科、鹿亞科；最后，它們與屬于豬科的豬鹿、牛科的水牛聚為一類(lèi)，親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。

圖7 哺乳動(dòng)物偶蹄目DBY基因NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的絨山羊細(xì)菌人工染色體BAC文庫(kù)保存在720個(gè)384孔板中，每個(gè)超級(jí)池由20個(gè)384孔板組成。以超級(jí)池為單位提取文庫(kù)DNA，分別得到超級(jí)池DNA 36個(gè)，二級(jí)池DNA 1 656個(gè)，每一個(gè)超級(jí)池含有二級(jí)池DNA 46個(gè)，其中板池20個(gè)，行池16個(gè)，4列池4個(gè)，6列池6個(gè)，共有288個(gè)行池、180個(gè)列池、360個(gè)板池，含有27×104個(gè)克?。?2］，因此精確的定位對(duì)于獲得正確的陽(yáng)性克隆至關(guān)重要。本研究在BAC文庫(kù)的定位PCR篩選過(guò)程中，由于文庫(kù)具有11.8倍的覆蓋率，所以首先必須保證合適濃度的篩庫(kù)工作液，其次要有優(yōu)化的擴(kuò)增體系和擴(kuò)增條件，因此需要對(duì)擴(kuò)增的體系和條件進(jìn)行大量的摸索工作，得到最優(yōu)化體系。但由于在設(shè)計(jì)引物時(shí)，沒(méi)有山羊的模板序列，選用GenBank收錄的牛DBY基因序列設(shè)計(jì)引物，引物的特異性不強(qiáng)，在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，體系難以建立，所以在篩庫(kù)中，基因難以定位。為了加快篩庫(kù)速度，提高效率，采用正交拉丁方優(yōu)化體系，并經(jīng)過(guò)驗(yàn)證，方法可行。通過(guò)優(yōu)化的擴(kuò)增體系和條件所得的陽(yáng)性克隆經(jīng)測(cè)序?yàn)槟康目寺　６掖搜芯揩@得的Y染色體DBY基因片段填補(bǔ)了山羊該基因序列空白。通過(guò)序列比對(duì)，DBY基因在?？苿?dòng)物中具有一定的保守性，而與其他物種的保守性很差，尤其與人和黑猩猩及小鼠的序列無(wú)同源性，而人和小鼠之間DBY卻有較高的相似性［6］。NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)得出山羊、綿羊、水牛等物種間在NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中所反映的親緣關(guān)系同其在分類(lèi)學(xué)中的位置基本一致［13］。Foresta等［6］在對(duì)人類(lèi)Y染色體AZFa區(qū)基因進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)DBY有17個(gè)外顯子，編碼一個(gè)ATP依賴(lài)的RNA解旋酶，屬于DEAD BOX（Asp-Glu-Ala-Asp）家族。但本研究所得的片段中編碼序列無(wú)天冬氨酸編碼，與其有差異。這可能是由于克隆片段的編碼序列太短，基因序列不完整造成的，也可能是由于山羊和人及小鼠的同源性差，編碼序列不同的緣故。因此，山羊的DBY基因的結(jié)構(gòu)、進(jìn)化及功能還有待進(jìn)一步研究。后續(xù)將對(duì)獲得的405D22 BAC測(cè)序，并對(duì)測(cè)序序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。并以此BAC末端序列為模板設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行絨山羊Y染色體其他BAC的篩選，獲得山羊Y染色體功能區(qū)序列，逐步構(gòu)建Y染色體序列的contig。

4 結(jié)論

首次獲得山羊Y染色體DBY基因片段240bp，共編碼52個(gè)氨基酸；其與綿羊、牛的同源性較高，而與人、黑猩猩及小鼠無(wú)同源性；經(jīng)鑒定篩選出的405D22基因組BAC為山羊Y染色體BAC。

［1］ Foresta C, Moro E, Ferlin A.Y Chromosomemicrodeletions and alterations of spermatogenesis ［J］.Endocrine Reviews, 2001, 22（2）：226-239.

［2］ Tiepolo L, Zuffardi O.Localization of factors controlling spermatogenes is in the nonfluorescent portion of thehuman Y chromosome long arm ［J］.Hum Genet, 1976, 34（2）：119-124.

［3］ Vogel T, Speed RM, Ross A, Cooke HJ.Partial rescue of the Dazl knock outmouse by thehuman DAZL gene ［J］.Mol Hum Reprod,2002, 8（9）：797-804.

［4］ Mazeyrat S, Saut N, Sargent CA, et al.Themouse Y chromosome interval necessary for spermatogonial proliferation is gene dense with syntenichomology to thehuman AZFa region ［J］.Hum Mol Genet,1998, 7（11）：1713-1724.

［5］ Liu WS, Wang A, Yang Y, et al.Molecular characterization of the DDX3Y gene and itshomologs in cattle ［J］.Cytogenet Genome Res, 2009, 126（4）：318-328.

［6 ］ Foresta C, Ferlin A, Moro E.Deletion and expression analysis of AZFa genes on thehuman Y chromosome revealed amajor role for DBY inmale infertility ［J］.Hum Mol Genet, 2000, 9（8）：1161-1169.

［7 ］ Gueler B, Sonne SB, Zimmer J, et al.AZFa protein DDX3Y is differentially expressed inhumanmale germ cells during development and in testicular tumours：new evidence for phenotypic plasticity of germ cells ［J］.Hum Reprod, 2012, 27（6）：1547-1555.

［8 ］ Kleiman SE, Yogev L, Hauser R, et al.Expression profile of AZF genes intesticular biopsies of azoospermicmen ［J］.Hum Reprod,2007, 22（1）：151-158.

［9 ］ Foresta G, Moro E, Rossi A, et al.Role of the AFZa candidate genes inmale infertility［J］.J Endocrinao Invest, 2000, 23（10）：646-651.

［10 ］ Yao CJ, Xu WJ, Gong XL, et al.The role of DbymRNA in early development ofmalemouse zygotes ［J］.Asian Journal of Andorlogy, 2010, 12（4）：567-577.

［11］ Vong QP, Li Y, Lau YF, et al.Structural characterization and expression studies of Dby and itshomologs in themouse ［J］.J Androl, 2006, 27（5）：653-661.

［12］ 劉志紅.絨山羊BAC文庫(kù)的構(gòu)建與鑒定以及絨毛生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因的篩選［D］.呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué), 2009.

［13］ 常洪.動(dòng)物遺傳資源學(xué)［M］.北京：科學(xué)出版社, 2009.