曾賢彬 王永 劉仲娜 馬志杰 海汀 鐘金城

熱休克轉(zhuǎn)錄因子HSFY（heat shock transcription factor，Y chromosome）是哺乳動物4種熱休克因子（HSF1、HSF2、HSF4和HSFY）之一，控制熱休克蛋白表達［1］。HSFY 與其它 HSFs（HSF1和HSF2）具有不同的功能［2］。Tessari等［3］將 HSFY作為人精子發(fā)生障礙的候選基因之一。Giovanna［4］、Shinka［2］、Ferlin［5］等報道 HSFY 基因缺失與無精子、少精子癥緊密相關(guān)。

Tessari［3］、Christine［6］等對人、恒河猴、普通牛、家貓、挪威鼠的HSFY蛋白質(zhì)序列進行了多序列比對，結(jié)果顯示，普通牛與家貓親緣關(guān)系最近，兩物種間的該基因編碼區(qū)和與DNA結(jié)合的結(jié)構(gòu)域的序列一致性分別為58％和81％。目前認為，HSFY基因是Y染色體上的多拷貝基因。人有6個拷貝，其中兩個功能拷貝；家貓有8個功能拷貝，拷貝數(shù)未知；普通牛約有73個拷貝，功能基因數(shù)未知［3，6，7］。人、普通牛的HSFY主要在睪丸中特異表達［3，8］，即HSFY僅在支持細胞和精母細胞中表達［2］，其mRNA表達水平與精原細胞和精母細胞標記（UCHL1和 TRPC2）mRNA 表達水平顯著相關(guān)（P＜0.0001）［6］。用抗HSFY抗體證實，正常精子生成時，HSFY在曲細精管的生殖細胞和支持細胞中表達。精原細胞期、精母細胞細線期均無HSFY表達信號；偶線期染色質(zhì)周圍有強HSFY表達信號，但在精子成熟后HSFY蛋白量減少［9］，表明其與精子生成有關(guān)，但其生物學(xué)功能尚待研究［2-4，10］。

有關(guān)牦牛HSFY基因的研究尚未見報道，本研究對牦牛的HSFY基因進行克隆測序、結(jié)構(gòu)和密碼子偏好性分析以及與普通牛等其他物種相應(yīng)基因進行比對研究，以期為進一步研究牦牛HSFY基因的結(jié)構(gòu)和功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

在四川省龍日種畜場選取健康成年公牦牛兩頭，采取耳組織，置于75％乙醇中帶回實驗室，保存于-20℃冰箱中備用。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 按試劑盒（天根公司）操作說明提取基因組DNA。

1.2.2 牦牛HSFY基因克隆測序 根據(jù)普通牛HSFY2序列（NC_016145.1）設(shè)計引物，上下游引物分別為F：5'-TCACAGCCTTTTGACTTTG-3'、R：5'-CTCTTTTCCCTTGCTTCTC-3'；引物由上海Invitrogen公司合成。

25μL PCR反應(yīng)體系：基因組 DNA 1μL、上下游引物各1μL、ddH2O 9.5μL 和 2×long Taq酶（博奧維新公司）12.5μL 。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3min；95℃變性30s，56℃復(fù)性30s，72℃延伸1.5min，共30個循環(huán)；72℃終延伸10min，4℃保存。

經(jīng)膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，與pMD19-T（購自TaKaRa公司）于16℃過夜連接，其產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌（DH5α）感受態(tài)細胞，涂布于含50μg/mL氨芐青霉素、200mg/mL IPTG及20mg/mL X-Gal的LB平板，過夜培養(yǎng)。經(jīng)PCR篩選陽性克隆進行測序。

1.2.3 序列分析 測序結(jié)果用DNAMAN4.0、DNAssist1.0等生物信息學(xué)軟件進行拼接、比對分析，用 GENSCAN（http：//genes.mit.edu/GENSCAN.html）預(yù)測蛋白的氨基酸序列，并與普通牛（NP_001070-474）、瘤牛（AFV09891）、人（hHSFY1：NP_1490-99.2；hHSFY2：NP_714927.1）、挪威鼠（NP_00101-2132.1）、家短尾負鼠（ACT35160）、恒河猴（ACL-51668.1）、家貓（NP_001035212.1）等的 HSFY 蛋白的序列用 Clustal W［11］進行多序列比對［6］，用MEGA5軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。在UCSC基因組瀏覽器（http：//genome.ucsc.edu/）的普通?；蚪M中，以HSFY引物對搜索，選取位于Y染色體上的HSFY相似序列。GENSCAN預(yù)測外顯子區(qū)域，condon W（http：//mobyle.pasteur.fr/cgi-bin/portal.py?#forms：：codonw）分析其密碼子偏好性和有效密碼子數(shù)等。用 SWISS-MODEL（http：//swissmodel.expasy.org/）同源建模構(gòu)建HSFY蛋白三維結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴增結(jié)果

經(jīng)PCR擴增，電泳檢測為一清晰條帶（圖1）。結(jié)合普通牛HSFY2序列（NC_016145.1），通過DNA分子量標準和測序結(jié)果分析得知，牦牛HSFY基因PCR產(chǎn)物大小為2000bp左右，與預(yù)期結(jié)果一致。

圖1 牦牛HSFY基因的PCR擴增電泳圖

2.2 牦牛HSFY基因的核苷酸序列及其比對

本研究得到的牦牛HSFY基因由2個外顯子和1個內(nèi)含子組成，與普通牛基因組中的相應(yīng)序列進行比對，其一致性高達99.54％。第一外顯子未出現(xiàn)插入/缺失，但在1012-1020bp（Ⅰ）處有AAAGAAGA/TG等9個核苷酸缺失，位于內(nèi)含子內(nèi)；在1071-1073bp（Ⅱ）、1249-1251bp（Ⅲ）處分別有AAG、CCA/C等3個核苷酸缺失，位于第二外顯子內(nèi)，分別導(dǎo)致賴氨酸和組氨酸的缺失；在1 708-1 710bp（Ⅳ）處有CAA 3個核苷酸缺失，位于3'-URT。在普通牛HSFY基因的84條序列中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ插入/缺失分別有29、3、2、1次，未發(fā)現(xiàn)Ⅱ、Ⅲ同時缺失的拷貝，但Ⅱ、Ⅲ缺失均伴有Ⅰ缺失。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ插入/缺失的序列與其相鄰序列極為相似（圖2）。

圖2 兩條牦牛HSFY基因序列與普通牛部分相應(yīng)序列的比對

HSFY基因在許多物種中為多拷貝基因，但在物種內(nèi)序列的相似性極高，人的兩個功能拷貝的氨基酸序列相似性達100％。本研究得到的牦牛HSFY序列1僅有Ⅲ缺失，且預(yù)測的基因剪切方式也與普通牛中具有功能的HSFY基因剪切方式一致。相對序列2含有Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ3處缺失，序列1預(yù)測的氨基酸序列更能反映牦牛HSFY蛋白質(zhì)信息。其與人、恒河猴、普通牛、瘤牛、家貓、挪威鼠、家短尾負鼠的HSFY蛋白的氨基酸序列進行多序列比對，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹（圖3）。牦牛與普通牛、瘤牛首先聚為一類，再相繼與家貓、家短尾負鼠、人等聚類，聚類結(jié)果與動物學(xué)分類結(jié)果基本一致。

圖3 牦牛與普通牛等物種HSFY的系統(tǒng)進化關(guān)系

2.3 牦牛HSFY蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)

以牦牛序列1的氨基酸序列為基礎(chǔ)序列，研究HSFYⅡ、Ⅲ插入/缺失與蛋白的三維結(jié)構(gòu)變化情況。結(jié)果（圖4）表明，Ⅱ與Ⅲ的單獨缺失與Ⅱ和Ⅲ均缺失的三維結(jié)構(gòu)基本一致，但與Ⅱ、Ⅲ均未缺失的結(jié)構(gòu)差異較大。Ⅱ、Ⅲ插入/缺失對應(yīng)的帶正電荷的賴氨酸、組氨酸比較傾向于位于蛋白表面，通過靜電作用等維持HSFY蛋白的立體結(jié)構(gòu)，Ⅱ、Ⅲ任一缺失均使HSFY蛋白的立體結(jié)構(gòu)塌陷。Ⅱ、Ⅲ插入/缺失可能會使HSFY蛋白的功能發(fā)生變化進而影響精子發(fā)生。

2.4 牦牛HSFY基因的密碼子偏好性

以牦牛HSFY序列1作為密碼子偏好性分析，GENSCAN預(yù)測得到長1131bp的蛋白編碼區(qū)。A、T、C和G分別占33.24％、29.27％、20.34％和17.15％，A3s、T3s、G3s和C3s分別為30.77％、37.93％、15.91％和15.38％，其中G+C、G3s+C3s含量分別為37.19％和31.30％。有效密碼子數(shù)為46.82?？梢姡琀SFY基因偏好使用A、T和以A、T結(jié)尾的密碼子，UUU、UUG、CUU、AUU、GUG、UAU、CAU、CAA、GAA、GAU、UCU、UCA、CCU、CCA、ACU、ACA、GCU、GCA、UGU、AGA、AGG、GGC和 GGA等 23個密碼子RSCU（相對密碼子使用度）均大于1，為牦牛HSFY偏好性密碼子；Asn、Lys、Arg、Ser 4個氨基酸沒有密碼子偏好現(xiàn)象；除編碼Leu、Val、Arg、Gly的UUG、GUG、AGG、GGC外，避免密碼子后兩位以G或C結(jié)尾，尤其以CG結(jié)尾如CCG、ACG、GCG的 RSCU為 0（表1）。

圖4 牦牛HSFY蛋白質(zhì)的Ⅱ、Ⅲ插入/缺失的三維結(jié)構(gòu)

3 討論

3.1 關(guān)于牦牛HSFY基因的拷貝數(shù)

在人體中，研究發(fā)現(xiàn)Yq11區(qū)存在與精子發(fā)生相關(guān)的基因，這些基因或基因家族又稱為無精子癥因子（azoospermia facter，AZF），目前已經(jīng)確定AZF由相互疊加的4個區(qū)域組成，即AZFa、AZFb、AZFc、AZFd［12，13］。HSFY 是位于 AZFb 區(qū)無精子癥因子候選因子之一。在許多物種中發(fā)現(xiàn)是由多拷貝組成的基因，人有6個拷貝，家貓有8個功能拷貝，普通牛約有73個拷貝［3，6，7］。以往的研究表明，牦牛與普通牛具有較近的親緣關(guān)系，在許多基因組成和基因結(jié)構(gòu)上都有相似性，本研究得到的2條牦牛HSFY基因序列雖在核苷酸組成上有一些差異，但相似性很高。因此認為牦牛的HSFY基因是一個多拷貝基因。

表1 牦牛HSFY序列1的RSCU

3.2 關(guān)于牦牛HSFY基因的結(jié)構(gòu)與遺傳變異

Hamilton等［6］研究普通牛HSFY基因的拷貝數(shù)在67-84范圍波動，基因表達和56天NRR系數(shù)（反映受精比率）均無顯著性差異。與Shaw-Smith［14］、Inoue［15］、Lupski［16］等研究表明的基因微量刪除和重復(fù)嚴重影響生物學(xué)功能現(xiàn)象不一致，推測是由多拷貝和基因調(diào)控序列區(qū)域變化兩種調(diào)節(jié)機制確保進行精子發(fā)生。該機制可能受到嚴格的自然選擇。本研究得到2條牦牛的HSFY序列，并搜索得到普通牛的HSFY序列84條，與Hamilton［6］研究結(jié)果基本一致，表明引物結(jié)合處比較保守，可以用于檢測HSFY基因缺失狀態(tài)。比對發(fā)現(xiàn)牦牛、普通牛有4處插入/缺失，其序列均分別與其相鄰序列極為相似，可能由染色體內(nèi)同源重組導(dǎo)致缺失的發(fā)生［17］。Ⅰ、Ⅳ缺失雖然不引起蛋白結(jié)構(gòu)的變化，但估計起轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，以便精細調(diào)節(jié)細胞中HSFY蛋白濃度變化彌補個別基因因突變或缺失造成的功能缺失。Ⅱ、Ⅲ插入/缺失對應(yīng)的賴氨酸和組氨酸的零深度相對傾向因子分別為30.850、15.312［18］，使均帶正電荷的賴氨酸、組氨酸傾向于位于蛋白表面，HSFY蛋白的立體結(jié)構(gòu)塌陷。Ⅱ、Ⅲ插入/缺失可能會使HSFY蛋白的功能發(fā)生變化進而影響精子發(fā)生。普通牛中Ⅱ和Ⅲ缺失均伴有Ⅰ缺失，很可能Ⅰ插入/缺失參與該基因的精確表達調(diào)控，但是使得該基因更易發(fā)生缺失突變。當然作者的這些推測還有待于進一步的生物試驗證實。

3.3 關(guān)于牦牛HSFY蛋白的結(jié)構(gòu)與功能

熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）是指所有生物細胞在應(yīng)激原刺激后，發(fā)生熱休克反應(yīng)時產(chǎn)生的一類細胞伴侶蛋白的總稱。該類蛋白在細胞生命過程中可參與蛋白的折疊、裝配及運輸?shù)然顒?，對調(diào)控細胞的生長、存活及分化起著重要作用。在哺乳動物中，HSP家族參與精子發(fā)生、精子獲能及受精等一系列活動，與雄性生殖過程密切相關(guān)［19］。研究表明，人和貓Y染色體上多拷貝基因都在睪丸組織中表達并行使功能［8，20-22］，則進一步推測牦牛HSFY在睪丸中表達和行使生物學(xué)功能。HSF成員HSF1、HSF2在精子發(fā)生中也起到了重要作用［23，24］。Ahn 等［25］報道，HSFY 和其它 HSFs（HSF1、HSF2、HSF4）的結(jié)構(gòu)不同，后者的中心螺旋型是由α-螺旋2和3組成，α-螺旋3是識別的DNA的螺旋結(jié)構(gòu)，然而HSFY有類似HSFs的DNA結(jié)合區(qū)，但沒有α-螺旋2和3。推測在精子發(fā)生活動中，HSFY可能具有與其它HSFs不同的調(diào)控HSP表達途徑。

蛋白質(zhì)序列變化［26］與其生物學(xué)功能變化密切相關(guān)。本研究中，牦牛、普通牛HSFY基因未發(fā)現(xiàn)Ⅱ、Ⅲ同時缺失，且Ⅱ、Ⅲ任意一處缺失與均缺失的三維結(jié)構(gòu)基本一致且有5個序列，占5.95％，可能與精子發(fā)生受阻相關(guān)。因缺失的比例較小和調(diào)控其它正?；?，確保了生物體精子發(fā)生正常?？赏ㄟ^Ⅱ、Ⅲ兩端的保守序列設(shè)計引物進一步研究其數(shù)量變化與生物活動變化之間的規(guī)律。值得一提的是基因密碼子的使用與基因表達的生理功能有密切聯(lián)系［27，28］。其不僅調(diào)控基因表達［29］，而且與翻譯的準確性和效率有關(guān)［30］。本研究以牦牛序列1預(yù)測的編碼區(qū)偏好使用A、T和以A、T結(jié)尾的密碼子?？紤]到該基因在小鼠精子發(fā)生過程中有瞬時高表達現(xiàn)象，估計牦牛HSFY翻譯比較低的準確度，更有利于瞬時高表達行使功能。但其生物學(xué)機制需要進一步研究。

4 結(jié)論

牦牛HSFY基因由2個外顯子和1個內(nèi)含子組成，是在睪丸中表達的多拷貝基因，與普通牛基因組中的相應(yīng)序列的一致性較高，屬于同源性的基因。

牦牛、普通牛的該基因具有4處插入/缺失，且序列與其相鄰序列極為相似。牦牛HSFY基因編碼的蛋白質(zhì)偏好使用以A或T結(jié)尾的密碼子。

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