張?jiān)奇?于定群 程怡 湯浩茹 王清明 張勇

在植物的花色成分中，類黃酮、甜菜素和類胡蘿卜素是三類最主要的色素［1，2］，且大多數(shù)植物花色素屬于類黃酮［3］。 查爾酮合成酶（chalcone synthase，CHS）是類黃酮類物質(zhì)合成的關(guān)鍵酶，在苯丙氨酸合成途徑中，香豆酰輔酶A 和丙二酰輔酶A 在查爾酮合成酶催化下產(chǎn)生苯基苯乙烯酮［4，5］。此中間物的異構(gòu)化和功能基團(tuán)的進(jìn)一步取代都能導(dǎo)致黃酮、異黃酮和花色素苷的合成。這些化合物為自然界提供了顏色，并參與了植物的多種生理過程，包括防紫外線輻射、抗病、生長(zhǎng)素運(yùn)輸、花粉的育性等［6，7］。查爾酮合成酶的表達(dá)受 UV 照射［8］、真菌侵染等條件誘導(dǎo)［9］，且在花中特異性表達(dá)［10］，其表達(dá)量的改變可能導(dǎo)致植物花色的變異［11］。CHS在植物中是普遍存在的，現(xiàn)認(rèn)為最早在陸生植物中出現(xiàn)。例如，輪藻綱和苔蘚植物［6，12-15］。 到目前為止在GenBank注冊(cè)的與CHS有關(guān)的核酸序列已經(jīng)有5000多條，涉及到的植物主要是豆科的大豆、苜蓿、豌豆；十字花科的擬南芥；禾本科的水稻、玉米；葡萄科的葡萄等，其中觀賞植物主要有矮牽牛、蓮、水仙、菊花、蝴蝶蘭和金魚草等［16］。

CHS轉(zhuǎn)基因的研究開展得比較廣泛。1986年，Coen 等［17］對(duì)金魚草的花色突變體研究表明，突變體花色變淡或變淺藍(lán)色，并推測(cè)該現(xiàn)象由CHS基因所控制。1990年 van der Krol等［18］將 CHS基因反義片段導(dǎo)入矮牽牛，結(jié)果花朵色素合成受阻，花冠顏色變淺，但花藥正常。1993年Elomaa等［19］利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將 CHS 基因反義片段導(dǎo)入非洲菊（Gerberahybrida）中，內(nèi)源CHS合成受到抑制，花色合成大大受阻，從而使花色發(fā)生改變。1994年Gutterson 等［20］利用正義和反義手段，將來自菊花（Chrysanthemummorifolium）的一個(gè)CHS基因?qū)腴_粉紅色花的菊花中，結(jié)果分別獲得了開淺紅色和白色花的轉(zhuǎn)基因植株。2000年Suzuki等［21］將CHS基因轉(zhuǎn)入藍(lán)色夏中，花瓣部分花色由藍(lán)色變?yōu)榘咨?005年Koseki等［22］在mRNA水平上分析了矮牽牛Red Star 6個(gè)花色苷生物合成過程中的重要基因發(fā)現(xiàn)，只有CHS基因的表達(dá)受到抑制才使花冠形成紅白相間的現(xiàn)象；2006年祝欽攏［23］將彩葉草CHS基因轉(zhuǎn)入煙草中，煙草葉片出現(xiàn)了色斑。從以上結(jié)果可以看出，CHS在植物花色呈現(xiàn)過程中的重要作用。

長(zhǎng)期以來月季的品種改良一直依賴于傳統(tǒng)的遺傳育種方法，關(guān)于通過調(diào)控CHS基因的表達(dá)量來改變?cè)录镜幕ㄉ珗?bào)道較少?；蚬こ碳夹g(shù)在觀賞植物花色育種上可彌補(bǔ)傳統(tǒng)育種技術(shù)的缺陷，可在保持原有性狀的基礎(chǔ)上，改變觀賞植物的花色，甚至創(chuàng)造該物種所不具有的花色，在較短時(shí)期內(nèi)培育出穩(wěn)定遺傳的新品種、新類型，孕育著巨大的經(jīng)濟(jì)效益。另一方面它也是研究基因表達(dá)、調(diào)控和互作機(jī)理的熱點(diǎn)課題。鑒于此，本試驗(yàn)希望通過克隆得到月季CHS基因序列及其表達(dá)分析，為進(jìn)一步花色基因工程作準(zhǔn)備。對(duì)月季進(jìn)行品種改良，使其花色更加多樣化，在園林上具有更好的觀賞價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 ‘仙境’月季（Rosahybrid）由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院提供，在晴朗的上午10點(diǎn)左右采集月季初開期（S1）、盛開期（S2）、衰敗期（S3）中層花瓣后，進(jìn)行液氮速凍，置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑 3％ CTAB，PVP，75％乙醇，氯仿，異丙醇，DEPC處理水，反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fermentas），瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（生工生物上海有限公司），Easy-GoTMRT PreMix（北京賽百盛基因技術(shù)有限公司），pMD19-T vector（寶生物工程大連有限公司），大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞JM109（寶生物工程大連有限公司），LB平板培養(yǎng)基以及其他常用試劑。

1.1.3 儀器 超低溫冰箱（Thermo，美國(guó)）、超純水系統(tǒng)（F4PN84631，MILLIPORE）、全自動(dòng)高壓滅菌鍋（TOMY，日本）、PCR（Polymerase Chain Reaction）儀（Bio-Rad，美國(guó)）、低溫高速離心機(jī)（Eppendorf，德國(guó)）、超凈工作臺(tái)（SW-CJ-2FD 型，蘇州安泰）、凝膠成像系統(tǒng)（SYNGENE，美國(guó)）、恒溫?fù)u床（HQL150C 型，武漢中科）、恒溫箱、電泳儀（北京六一儀器廠）、電泳槽、電熱恒溫干燥箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）、微波爐等。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取和cDNA第一條鏈的合成 花瓣總RNA的提取采用改良后的CTAB法［24］，在RNA提取過程中防止RNA污染，減少降解。按照反轉(zhuǎn)錄酶使用方法進(jìn)行合成 cDNA 第一條鏈，20μL PCR 反應(yīng)體系，此過程在冰上進(jìn)行。

1.2.2 查爾酮合成酶基因cDNA片段的克隆與測(cè)序 根據(jù)GenBank上已登錄的 CHS 同源基因的蛋白質(zhì)保守序列，利用CODEHOP軟件設(shè)計(jì)了一對(duì)簡(jiǎn)并引物，引物由上海生物工程有限公司合成。

引物：RhCHSF：5'-CCKTCHYTGGAYGCNMGRCARGAC-3'；RhCHSR：5'-GGBCCRAANCCRAANARMACACC-3'。對(duì)月季花瓣總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后合成的第一條鏈cDNA進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3min；94℃變性1min，47℃退火1min，72℃延伸1min，34個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；12℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)后用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的條帶，將回收產(chǎn)物與克隆載體pGEM-T easy連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，用藍(lán)白斑篩選重組子，篩選出陽性克隆及 PCR 檢測(cè)，選取經(jīng)鑒定含有目的片段的菌液送至測(cè)序。測(cè)序由上海英駿生物公司完成。

1.2.3 表達(dá)分析 采用半定量RT-PCR的方法，把月季在初花期（S1）、盛花期（S2）、衰敗期（S3）所提取的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后，合成單鏈cDNA。利用甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內(nèi)參，調(diào)整PCR 反應(yīng)模板量。根據(jù)RhCHS序列，設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物RhCHS forward 和reverse，引物RhCHSF：5'-CGACTACTACTTCCGTAT-3'；RhCHSR：5'-TTCAACAACCACCATATC-3'。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3min；94℃變性1min，47℃退火1min，72℃延伸1min，36個(gè)循環(huán)；15℃保存。

2 結(jié)果

2.1 總RNA的質(zhì)量檢測(cè)

從月季花瓣中提取的總RNA近無色，不呈膠狀，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，紫外凝膠成像儀觀察發(fā)現(xiàn)，在 RNA 條帶附近及點(diǎn)樣孔周圍沒有發(fā)亮現(xiàn)象，初步鑒定樣品基本不含多酚、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)；同時(shí)，如圖1所示，28S，18S和5S 條帶條帶清晰干凈，條帶之間不彌散。其中28S RNA條帶的亮度為18S RNA條帶的2倍，說明提取得到的總 RNA 完整性好。紫外分光光度計(jì)測(cè)定，A260/A280=1.91，A260/A230=1.79表明提取的總 RNA 樣品較純凈，樣品中多酚及蛋白質(zhì)的含量等雜質(zhì)很少，無 DNA污染。以上說明改良后的CTAB法適合月季花瓣 RNA的提取，且提取的總RNA 質(zhì)量較高，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 提取的月季花瓣總RNA電泳圖

2.2 CHS基因cDNA保守區(qū)序列的PCR擴(kuò)增

以逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA 第一鏈為模板，利用一對(duì)簡(jiǎn)并引物RhCHSF和RhCHSR進(jìn)行保守區(qū)擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，可見一條約850bp 的條帶（圖2）。對(duì)該片段進(jìn)行回收、連接轉(zhuǎn)化、測(cè)序，得到一段860bp的cDNA 序列與預(yù)期片段長(zhǎng)度一致。通過 Blast程序，與GenBank 上的其他植物的比較分析，該片段序列與已登錄月季品種（Kardinal：AB038246.1；Xing-xing-hei：HQ423171.1）、草莓（Fragaria×ananassa：AB201758.1）、樹莓（Rubus idaeus：AF400567.1）、 懸 鉤 子（Rubushybrid：JN602374.1）、碧桃（Prunus persica：JN391444.1）等植物的同源性達(dá)到 98％、92％、92％、87％和87％，推測(cè)該序列為CHS基因cDNA 的同源片段（表3）。

圖2 月季 CHS基因保守區(qū)序列擴(kuò)增電泳圖

表3 月季與其他薔薇科植物CHS基因同源性比較

2.3 不同時(shí)期月季查爾酮合成酶基因（CHS）的表達(dá)

采用RT-PCR的方法對(duì)CHS在月季花發(fā)育過程中的表達(dá)變化進(jìn)行分析，通過凝膠電泳（圖3）可以看出，衰敗期的CHS表達(dá)量幾乎沒有，而盛花期的表達(dá)量最高，CHS從初花到衰敗呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，與其花瓣顏色變化相一致，這是由于CHS影響花色素的積累。

3 討論

進(jìn)行分子生物學(xué)試驗(yàn)提取高質(zhì)量的RNA是最首要和關(guān)鍵一步，在提取RNA的過程中通常會(huì)受到污染物的干擾。植物組織中富含的糖、酚類、蛋白質(zhì)、植物次生代謝物質(zhì)，DNA等限制了高質(zhì)量RNA的分離［25，26］。目前，大多采用 CTAB 法提取 RNA［27-29］。本試驗(yàn)用的材料是花瓣，色素等次生代謝物質(zhì)較多，分離純凈的RNA難度較大，所以采取了改良后的CTAB法，通過凝膠電泳和分光光度法對(duì)提取的RNA進(jìn)行檢測(cè)，3條帶清晰完整，RNA的A260/A280在 1.8-2.0范圍內(nèi)，質(zhì)量較好，符合后續(xù)試驗(yàn)的要求，且該方法簡(jiǎn)單易行，耗時(shí)短。

將克隆得到的核苷酸基因序列翻譯成氨基酸序列，提交NCBI在線用BLAST 進(jìn)行搜索比對(duì)，RcCHS與其他植物有較高的同源性，說明CHS在進(jìn)化過程中的保守性。PCR擴(kuò)增遵循酶促反應(yīng)定律，開始的循環(huán)內(nèi)擴(kuò)增產(chǎn)物呈指數(shù)累積，產(chǎn)物和模板呈線性關(guān)系；當(dāng)達(dá)到平臺(tái)效應(yīng)時(shí)，隨著循環(huán)次數(shù)的增加，產(chǎn)物產(chǎn)率不再增加。半定量RT-PCR正是利用產(chǎn)物和模板的這一線性關(guān)系，通過擴(kuò)增來對(duì)比目的基因的表達(dá)。結(jié)果顯示，月季花瓣初開到衰敗，查爾酮合成酶基因表達(dá)的規(guī)律，先上升后下降，在盛花期達(dá)到峰值，衰敗期幾乎無表達(dá)，可能因?yàn)橹参锖笃诖x減緩，物質(zhì)分解消耗等原因。CHS基因是一個(gè)較大的基因家族，研究表明，在大部分植物當(dāng)中CHS存在多拷貝，在同源基因之間的表達(dá)呈現(xiàn)差異特性。例如，擬南芥中CHS基因在花、葉、果中都有表達(dá)［30］，而矮牽牛中的CHSA和CHSJ只在花粉囊和花冠中特異表達(dá)［31］。在一些植物中CHS在不同的發(fā)育時(shí)期表達(dá)的位置也不相同。在一些植物的早期發(fā)育階段，CHS出現(xiàn)在葉片組織中［32］，而成熟植株中主要限于花組織中表達(dá)［33］。CHS基因在同一器官中的表達(dá)部位也不盡相同。2006年，Mahroug等［34］通過原位雜交技術(shù)，表明長(zhǎng)春花CHS基因在花瓣的上表皮表達(dá)。而有些植物的CHS基因則在花藥中表達(dá)。2010年，宋婷婷等［35］在蘋果屬觀賞海棠 McCHS 基因的克隆及實(shí)時(shí)定量研究中推測(cè)CHS的相對(duì)表達(dá)量在整個(gè)葉片的發(fā)育過程中會(huì)逐漸發(fā)生改變或者發(fā)生不同部位、器官的特異表達(dá)。大量研究表明，CHS基因表達(dá)模式受到外界環(huán)境因子、上游啟動(dòng)子序列和轉(zhuǎn)錄因子共同調(diào)控。

本研究克隆到了月季花瓣查爾酮合成酶基因的片段，為以后獲得CHS全長(zhǎng)奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)探索了月季不同發(fā)育時(shí)期CHS的表達(dá)情況，為其著色機(jī)理和分子育種提供了理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

從月季（Rosahybrida）花瓣中成功提取出總RNA，獲得RhCHS的cDNA片段長(zhǎng)度為860bp，編碼287個(gè)氨基酸殘基，GenBank登錄號(hào)KC145553。同源序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，月季RhCHS與其他植物的同源性很高，說明CHS 在進(jìn)化的過程中具有高度的保守性。表達(dá)譜分析表明，CHS在盛花期表達(dá)量最高。

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