高藍(lán) 盧靜雯

植物激素通過調(diào)節(jié)有關(guān)基因的表達(dá)來調(diào)控植物的生長發(fā)育和植株對逆境脅迫的應(yīng)答反應(yīng)。其中乙烯可以調(diào)控植物的生長發(fā)育。如花的發(fā)育［1］，果實(shí)的成熟過程［2］，以及對病源侵染［3，4］、低氧［5］、低溫及干旱等逆境脅迫的應(yīng)答反應(yīng)［6］。在一些植物中，已知被植物激素乙烯調(diào)節(jié)的相關(guān)基因含有順式作用元件GCC盒（AGCCGCC序列）［7］。乙烯反應(yīng)元件因子（ERF）可以辨認(rèn)結(jié)合GCC盒［8］，是乙烯信號傳導(dǎo)中涉及的一類轉(zhuǎn)錄因子，已在多種植物中被分離鑒定。如煙草中的NtERF［9］、擬南芥的AtERF［10］、番茄的 leERF 和 Pti［3，11］、矮牽牛（Petuniahybrida）的 PhERF［1］、水稻的 OsERF［12］和大豆的GmEREBP1［13］等。ERF轉(zhuǎn)錄因子家族都含有一個(gè)保守的由60個(gè)左右氨基酸組成的結(jié)構(gòu)域（ERF結(jié)構(gòu)域），與擬南芥中的蛋白APETALA2的AP2結(jié)構(gòu)域相似［14］，是AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族中的ERF亞類，與DNA以單體的形式結(jié)合。ERF結(jié)構(gòu)域含有3個(gè)反平行的β-折疊和一個(gè)α-螺旋結(jié)構(gòu)［15］，其中這3個(gè)β-折疊結(jié)構(gòu)在識別順式作用元件的過程中具有重要作用。全基因組分析表明，擬南芥有122個(gè)ERF蛋白基因，水稻有139個(gè)ERF蛋白基因［12］。對各種植物的ERF的功能和表達(dá)研究則相對不多，如在擬南芥中只有少數(shù)ERF蛋白已經(jīng)確認(rèn)參與了對脅迫或?qū)σ蚁┑膽?yīng)答反應(yīng)［10，16］。在番茄中，已知Pto蛋白激酶是對丁香假單胞桿菌番茄致病變種（Pseudomonas syringae pv.Tomato）的抗性蛋白，Pti4、Pti5和Pti6蛋白可結(jié)合于Pto蛋白激酶基因的順式作用元件，促進(jìn)該激酶的表達(dá)［3］。蘋果的MdERF3，MdERF4，MdERF5和MdERF6因子在灰霉病菌（Botrytis cinerea）感染時(shí)表達(dá)增加，并可受乙烯的誘導(dǎo)［4］，瞬間在煙草中表達(dá)MdERF3可增加含GCC盒的幾丁質(zhì)酶的表達(dá)。在番茄中的LeERF1與果實(shí)的成熟相關(guān)，過表達(dá)ERF可增進(jìn)番茄果實(shí)的軟化和成熟［2］。

ERF類轉(zhuǎn)錄因子參與植物的多種生理過程和生長發(fā)育的調(diào)節(jié)，對于相關(guān)基因的分離及其表達(dá)和功能的研究有重要意義。本研究從梔子中分離GjERF的cDNA，并分析其在梔子不同組織和發(fā)育時(shí)期轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)，旨為研究其作用機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

梔子（Cardenia jasminoides）培養(yǎng)于廣東藥學(xué)院，隨著梔子果實(shí)的發(fā)育，采摘果肉為無色（發(fā)育期Ⅰ）及果肉為橙黃色（發(fā)育期Ⅱ）的梔子果實(shí)。并采摘梔子的成熟葉片。果實(shí)及葉片均經(jīng)液氮中速凍后，冷凍于-80℃。

1.2 方法

1.2.1 梔子cDNA文庫的構(gòu)建及隨機(jī)測序獲得GjERF基因序列 從梔子果實(shí)（發(fā)育期Ⅱ）中以CTAB［17］改良法提取總RNA，在液氮中研磨梔子果實(shí)，加入65℃ CTAB提取液（2％ CTAB（W/V），2％ PVPK30（W/V），100mmol/L Tris-HCl（pH8.0），25mmol/L EDTA（pH8.0），2.0mol/L NaCl）和 4％（V/V）β-疏基乙醇，保溫30min。接著以12000×g 在4℃離心10min，上清液加等體積苯酚∶氯仿∶異戊醇（25/24/1，V/V）抽提，接著以12000×g離心20min。水相加等體積4mol/L LiCl溶液沉淀RNA，4℃過夜。以12000 ×g離心20min，RNA沉淀以DEPC水溶解，接以0.1體積的3mol/L NaOAC（pH5.2）和2倍體積的無水乙醇在-20℃沉淀1h。最后以12000 ×g離心20min，RNA沉淀以75％乙醇洗滌，揮干后以DEPC水溶解?？俁NA用于構(gòu)建cDNA文庫，采用CreatorTMSMARTTMcDNA文庫構(gòu)建試劑盒（Clontech公司，美國）構(gòu)建梔子果實(shí)的cDNA文庫，按試劑盒說明書提供的方法操作。梔子的cDNA插入在質(zhì)粒pDNR-LIB中，轉(zhuǎn)入Escherichia coli strain DH5α。

在cDNA文庫中，隨機(jī)挑取單克隆，分別對每個(gè)單克隆進(jìn)行菌落PCR。挑取單克隆加入到25μL的超純水中，在PTC-200 PCR儀（MJ Research，USA）上加熱至95℃裂解5min，制得裂解液。接著以M13引物對用于檢測pDNR-LIB中的插入序列（CreatorTMSMARTTMcDNA文庫構(gòu)建試劑盒中提供），即對以上裂解液進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。采用PrimeStarTMHS DNA polymerase（TaKaRa公 司， 大連寶生物公司），反應(yīng)條件為：94℃變性5min，40輪循環(huán)的 94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 2min，最后72℃延伸7min。擴(kuò)增產(chǎn)物以1.2％的瓊脂糖凝膠電泳檢測，將片段長度大于750bp的相應(yīng)的單克隆挑出進(jìn)行液體培養(yǎng)，送華大基因完成測序。在隨機(jī)測序的序列中獲得了GjERF序列。

為了獲得GjERF基因的ORF序列，設(shè)計(jì)了以下引物，5'端引物為5'-GGAATTCCATATGTGTGGA GGTGCAATCATCGACG-3'，含有NdeI酶切位點(diǎn)。 3'端引物為5'-CCGACTCGAGTTAATACAGCAGATTAT TAGGCTGCTGGGCT-3'，含有Xho I酶切位點(diǎn)。將含有目的基因的菌種加入含氯霉素抗性的LB培養(yǎng)液，在37℃，150r/min搖床培養(yǎng)過夜。接著以4000r/min離心菌液5min。挑取菌體沉淀加入到50μL的超純水中，95℃裂解5min，制得裂解液。做菌落PCR，得到目的DNA。PCR反應(yīng)條件為94 ℃變性5min，接 35輪循環(huán)的 94℃ 30s，63.5℃ 30s，72℃ 1.5min，最后72℃延伸7min。擴(kuò)增產(chǎn)物以1.2％的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.2 序列分析和空間結(jié)構(gòu)預(yù)測 基因序列中的ORF以及預(yù)測編碼蛋白的保守域的搜索以O(shè)RF Finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/）和 BLAST進(jìn)行。多重序列比對以在線ClustalW2（http：//www.ebi.ac.uk/clustalw/index.html）進(jìn)行。進(jìn)化分析以Mega 4軟件中的neighbor-joining算法完成?？臻g結(jié)構(gòu)預(yù)測以SWISS-PDB軟件在線分析完成。

1.2.3 GjERF基因的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)分析 分別取梔子發(fā)育期Ⅰ和Ⅱ的果實(shí)及梔子的成熟葉片，3種樣品按1.2.1方法提取總RNA，以Prime Script one step RT-PCR試劑盒（TaKaRa，大連寶生物公司），按試劑盒說明書將GjERF的mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。引物為：正向：5'-GCTTCCAAGCTCAGCCTTACTA-3'，反 向：5'- AGATCATCCAGCATCCAGAGAC-3'。RTPCR的內(nèi)標(biāo)為梔子的RPS25-1（核糖體小亞基的25-1蛋白，GenBank登錄號GU797554），其擴(kuò)增引物為：正向：5'- CAGAAGAAGAAGAAGTGGAGCAA-3'，反向：5'- GTTCTTGAACCACTTGATGGTCT-3'。擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行二次，PCR反應(yīng)條件均為：94℃變性5min，接 35輪循環(huán)的 94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1min，最后72℃延伸10min。

2 結(jié)果

2.1 梔子GjERF基因的克隆

從梔子果實(shí)cDNA文庫中隨機(jī)篩選獲得梔子乙烯反應(yīng)元件結(jié)合蛋白ERF的cDNA，命名為GjERF，GenBank登錄號為HQ599862。該基因全長962bp，5'端非翻譯區(qū)長82bp，3'端非翻譯區(qū)長100bp，預(yù)測ORF為780bp，編碼259個(gè)氨基酸，分子量為28.6kD，等電點(diǎn)為6.764。GjERF基因的ORF擴(kuò)增結(jié)果見圖1。

2.2 GjERF蛋白序列分析和空間結(jié)構(gòu)預(yù)測

圖1 GjERF 的ORF擴(kuò)增電泳圖

圖2 GjERF的聚類分析

通過BLAST分析，GjERF的蛋白質(zhì)序列含有AP2/ERF結(jié)構(gòu)域，與多種植物的ERF相似。經(jīng)ClustalW2比對和MEGA4.0分析，得到GjERF與20條在BLAST比對中與GjERF最相似的ERF的親緣關(guān)系圖，見圖2。GjERF與唇形超目唇形科的丹參（Salviamiltiorrhiza）的ERF關(guān)系最近（序列相似度50.57％），梔子和丹參同屬唇形超目。GjERF與金縷梅超目山毛櫸科的歐洲栗（Castanea sativa）的關(guān)系較遠(yuǎn)（序列相似度25.86％）。將GjERF與丹參、棉花（Gossypiumhirsutum）、葡萄（Vitis vinifera）、番茄（Solanum lycopersicum）的ERF，以及來自擬南芥（Arabidopsis thaliana）AtERF1的ERF結(jié)構(gòu)域（在PDB中的編號為1GCC_A，序列范圍145-206）進(jìn)行了比對，序列相似度分別為50.57％、49.09％、48.39％、44.09％和16.54％；而GjERF的AP2/ERF結(jié)構(gòu)域（序列范圍75-133）與這幾種植物ERF的AP2/ERF結(jié)構(gòu)域的相似度則在68.25％-86.89％范圍，而在此結(jié)構(gòu)域中推測與DNA有相互作用的氨基酸殘基則在所有參比的ERF中完全相同，見圖3。以1GCC_A為模板，由Swiss-model預(yù)測的GjERF中AP2/ERF結(jié)構(gòu)域的二級結(jié)構(gòu)也在圖中標(biāo)出。按照GjERF的序列結(jié)構(gòu)，其N端具有未知功能的MC結(jié)構(gòu)域（MCGGAII），因?yàn)檫@個(gè)顯著特征，將其劃分為ERF因子中的第Ⅶ類。

圖 3 GjERF與5個(gè)ERF的序列對比

以來自擬南芥的AtE-RF1的ERF結(jié)構(gòu)域（序列范圍145-206）與DNA的GCC盒雙鏈的復(fù)合物（即1GCC_A）為模板，該復(fù)合物中的DNA編碼鏈序列為：5'-GCTAGCCGCCAGC-3'，劃線序列為GCC盒核心序列，另一條為互補(bǔ)鏈。1GCC_A的蛋白序列與GjERF的ERF結(jié)構(gòu)域（序列范圍75-133）的相似度為75.44％，由該復(fù)合物作為模板預(yù)測的GjERF的ERF結(jié)構(gòu)域的3D結(jié)構(gòu)，見圖4。

圖4 1GCC-A中ERF結(jié)構(gòu)域與DNA復(fù)合物的空間結(jié)構(gòu)及預(yù)測的GjERF中ERF結(jié)構(gòu)域的空間結(jié)構(gòu)

在1GCC_A結(jié)構(gòu)中，擬南芥的ERF結(jié)構(gòu)域與GCC盒通過3個(gè)β折疊在DNA的大溝處相互作用。從N到C端方向的第二個(gè)β-折疊幾乎與α-螺旋平行，也與DNA編碼鏈的5'到3'方向平行。主要涉及的作用有，結(jié)構(gòu)域中的精氨酸的胍基與GCC盒中的鳥嘌呤經(jīng)氫鍵互相作用，而精氨酸的骨架結(jié)構(gòu)則與嘧啶堿基有疏水性相互作用。色氨酸與嘌呤堿基有疏水性相互作用。這些精氨酸和色氨酸殘基除與堿基作用外，還與糖磷酸骨架有疏水性相互作用。DNA分子則在大溝的CG堿基對有約20℃的彎曲，有利于蛋白質(zhì)與DNA之間的相互作用。預(yù)測的GjERF的空間結(jié)構(gòu)與1GCC_A相似。

2.3 GjERF基因在果實(shí)發(fā)育過程中的表達(dá)

GjERF在梔子成熟葉片，發(fā)育期Ⅰ和Ⅱ的果實(shí)中的轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)，見圖5。以特異引物擴(kuò)增cDNA，以梔子RPS25-1作為內(nèi)標(biāo)?？煽吹剑珿jERF在葉片中的表達(dá)水平比在果實(shí)中高，隨著果實(shí)的發(fā)育過程，GjERF轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)維持不變。

圖5 GjERP在葉片和果實(shí)兩個(gè)發(fā)育時(shí)期（Ⅰ和Ⅱ）轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)

3 討論

ERF類轉(zhuǎn)錄因子作為AP2/ERF類轉(zhuǎn)錄因子中的一類，參與植物多種基因的表達(dá)從而調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育和對乙烯、生物和非生物性脅迫的反應(yīng)。按照其蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)上的特點(diǎn)，有幾種分類方法將ERF 類轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)一步分類［11，12，18，19］。其中 Nakano等［12］將擬南芥的122個(gè)ERF蛋白分為12族，包括Ⅰ-Ⅴ，Ⅵ-Ⅹ，Ⅵ-L和Xb-L。其中第Ⅶ類ERF類轉(zhuǎn)錄因子在其蛋白序列N端具有MC結(jié)構(gòu)域。

在對第Ⅶ類ERF的研究中發(fā)現(xiàn)其在植物不同組織中的表達(dá)往往不同，并有多個(gè)ERF參與果實(shí)的成熟和衰老過程［20］。如番茄的LeERF2屬于第Ⅶ類，它可被乙烯誘導(dǎo)，隨果實(shí)的成熟轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)增加，在成熟抑制的番茄突變體Nr（Never-ripe），nor（non-ripening）和 rin（ripening inhibitor）中幾乎不表達(dá)［20］。蘋果（Malus domestica）的 MdERF1主要在成熟果實(shí)中表達(dá)，在其它組織中很少表達(dá)［21］。從李（Prunus salicina）中分離得到的PsERF2a和PsERF2b隨果實(shí)的發(fā)育過程的表達(dá)則沒有呈現(xiàn)遞增或遞減的規(guī)律，而是在花中高水平表達(dá)［22］。在獼猴桃（Actinidia deliciosa）中，AdERF4，AdERF5和AdERF6的表達(dá)則是AdERF4、AdERF 6隨果實(shí)的發(fā)育成熟表達(dá)逐漸下降。另外，AdERF4在葉中的表達(dá)僅次于果實(shí)發(fā)育初期的水平；AdERF5的表達(dá)水平在所有組織和果實(shí)發(fā)育過程中均很低，相對的在花和成熟果實(shí)中有少量表達(dá)［23］。葡萄中的第Ⅶ類的VvERF057、VvERF058和VvERF059在葡萄由轉(zhuǎn)熟期到全熟期的表達(dá)沒有任何變化，而第Ⅸ類的兩個(gè)ERF轉(zhuǎn)錄因子VvERF078和085則與幾丁質(zhì)酶，β-1，3-葡聚糖酶和甜蛋白隨葡萄果實(shí)的發(fā)育過程同步表達(dá)［24］。對甜瓜品種河套蜜瓜果實(shí)中的第Ⅶ類ERF因子CMeERF2的表達(dá)的研究發(fā)現(xiàn)，隨著果實(shí)的發(fā)育成熟過程及乙烯含量的增加而逐漸增加，在受粉后38d內(nèi)其轉(zhuǎn)錄水平較低，乙烯含量較少；在受粉后40d時(shí)，果實(shí)內(nèi)源乙烯含量達(dá)到峰值，其轉(zhuǎn)錄水平也達(dá)到峰值；在受粉后45d之后，隨著果實(shí)內(nèi)源乙烯水平的下降，其轉(zhuǎn)錄水平也下降。同時(shí)，也發(fā)現(xiàn)不屬于第Ⅶ類ERF因子的CMeERF1的表達(dá)也有類似的規(guī)律［25］。所以第Ⅶ類ERF因子與果實(shí)的發(fā)育過程的關(guān)系也是復(fù)雜的，有時(shí)并不相關(guān)，而其它亞類的ERF因子也有可能與果實(shí)的發(fā)育成熟過程有關(guān)。本研究獲得的GjERF基因在梔子葉片中的表達(dá)強(qiáng)于在果實(shí)中的表達(dá)，并不隨果實(shí)的發(fā)育而增強(qiáng)，顯示其表達(dá)與果實(shí)的發(fā)育無關(guān)并具有組織特異性。隨著對植物AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆及基因的表達(dá)和功能的研究，將更有助于對植物的抗逆機(jī)制和生長發(fā)育的調(diào)控機(jī)理的深入了解。這是首次在梔子中分離ERF類轉(zhuǎn)錄因子及考察其在不同組織和發(fā)育時(shí)期表達(dá)的報(bào)道。

4 結(jié)論

克隆了梔子的GjERF基因，該基因預(yù)測編碼第Ⅶ類ERF轉(zhuǎn)錄因子。該轉(zhuǎn)錄因子的ERF結(jié)構(gòu)域預(yù)測可與順式作用元件GCC盒發(fā)生相互作用。GjERF在梔子葉中的轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)強(qiáng)于在果實(shí)中的表達(dá)，并不隨果實(shí)的發(fā)育而改變其表達(dá)水平。

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