陳宇杰 陳明 烏蘭巴特爾 郝金鳳 高峰 哈斯阿古拉

乙烯作為一種重要的植物激素，在植物生長發(fā)育、成熟衰老等諸多生理過程中起著極為重要的作用［1］。乙烯受體是乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的一個關(guān)鍵因子，研究表明乙烯受體的存在是乙烯應(yīng)答順利進行所必需的［2］。編碼乙烯受體的基因?qū)儆诙嗷蚣易?，在擬南芥乙烯受體基因家族中已發(fā)現(xiàn)5個成員ETR1、ERS1、ETR2、ERS2和EIN4［3］，根據(jù)其結(jié)構(gòu)特征，將乙烯受體家族成員分成兩個亞家族，亞家族Ⅰ包括ETR1和ERS1，亞家族Ⅱ包括ETR2、ERS2和EIN4。目前，人們已經(jīng)從番茄［4］、梨［5］等多種果實中克隆到了乙烯受體基因ETR1。1999年，Sato-Nara等［6］從甜瓜品種FuyuA和Natsu4中克隆到Cm-ETR1cDNA序列，基因表達分析結(jié)果表明，Cm-ETR1在完全膨大期果實果皮有少量表達，在成熟早期和后期的果皮中的表達逐漸增強。但目前尚不了解該基因在甜瓜果實成熟及呼吸躍變過程中的確切功能。

本研究以典型的呼吸躍變型甜瓜品種河套蜜瓜為研究對象，從成熟果實中克隆Cm-ETR1cDNA全長序列，分析果實不同發(fā)育時期內(nèi)源乙烯生成規(guī)律，并應(yīng)用定量PCR技術(shù)分析該基因在甜瓜果實發(fā)育成熟過程中的表達特性，為闡明Cm-ETR1 基因在甜瓜果實成熟及呼吸躍變過程中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

甜瓜品種河套蜜瓜（Cucumismelo L.cv Hetao）原種，由本實驗室保存。選取大田種植的9個成熟果實，取中果皮組織于液氮速凍，用于基因克隆。從授粉后0d開始，每隔5d采摘果實，直至果實完全成熟變軟，取中果皮組織于液氮速凍，用于基因表達分析。為保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可靠性，每天上午9時采摘果實，重復(fù)3次。

大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α由本實驗室保存。反轉(zhuǎn)錄試劑盒為Invitrogen公司產(chǎn)品；克隆載體pMD19-T、限制性內(nèi)切酶、PrimeSTARTMHS DNA聚合酶、dNTPs、氨芐青霉素、 DNAmarker以及SYBR? Premix Ex TaqTM定量PCR試劑盒等為大連寶生物公司產(chǎn)品；PCR產(chǎn)物純化試劑盒為上海生工生物工程有限公司產(chǎn)品；其余試劑為進口或國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取 采用乙酸鉀-氯化鋰方法［7］提取甜瓜果實總RNA。由于甜瓜果皮富含多糖，多糖能夠與核酸形成復(fù)合物并共沉淀下來，影響下一步的反轉(zhuǎn)錄PCR擴增，本試驗利用乙酸鉀將水相中的多糖選擇性的沉淀出來，達到了除去多糖的目的。

1.2.2 引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank中登錄的甜瓜乙烯受體基因Cm-ETR1cDNA序列（登錄號：AF054806），設(shè)計合成RT-PCR引物，上游引物P1序列為：5'-CTACTCTAGATTGCCATGGAGAACTGTT-3'，下游引物P2序列為：5'-TGACGGATCCGATATCTCTCTGTCTACT-3'。根據(jù)所克隆的Cm-ETR1基因cDNA序列，設(shè)計合成該基因的定量PCR檢測引物，上游引物P3為：5'-GCAACTGCCCTTATGCTTGT-3'，下游引物P4為：5' -CTTGAGTACGAATGAGTCCC-3'，擴增片段大小為121bp。以甜瓜甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）基因（登錄號：AB033600）為定量PCR檢測內(nèi)參基因，上游引物GP1為：5'-ATCATTCCTAGCAGCACTGG-3'，下游引物GP2為：5'-TTGGCATCAAATATGCTTGACCTG-3'，擴增片段大小為278bp。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.3 PCR擴增和克隆 取5μg河套蜜瓜總RNA做模板，加50μmol/L Oligo（dT）20引物1μL，加10mmol/L dNTP 2μL，滅菌無RNase水5μL，65℃變性5min，迅速放在冰上5min；然后依次加入5×cDNA合成緩沖液4μL、0.1mol/L dTT 1μL、15U/μL反轉(zhuǎn)錄酶M -MLV 1μL、40U/μL RNase-out 1μL。反應(yīng)條件：50℃，50min；60℃，10min；70℃，10min；85℃，5min；4℃，5min。反應(yīng)結(jié)束后，加2U/μL RNase H 1μL，37℃保溫30min，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

以合成的cDNA第一鏈為模板，建立常規(guī)的PCR反應(yīng)體系，采用PrimeSTARTMHS DNA聚合酶擴增Cm-ETR1基因全長cDNA 。PCR 反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性2min；94℃變性50s，50℃退火40s，68℃延伸2min；35個循環(huán)，68℃延伸10min。PCR產(chǎn)物進行1.0％瓊脂糖凝膠電泳。

PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后與經(jīng)SmaⅠ酶切的pUC19載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，在含有Amp（100mg/L）的LB平板上篩選陽性克隆，經(jīng) XbaⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定，分別從3個獨立PCR產(chǎn)物的重組克隆中各選取1個克隆，進行序列分析。將所得序列結(jié)果與已報道的cantalupenis甜瓜ETR1基因cDNA進行BLAST序列相似性分析，用 DNAMAN6.0軟件進行序列比較分析。

1.2.4 在GenBank中進行Cm-ETR1蛋白BLAST比對，搜索到一批相似性很高的蛋白，從中選出9個相似性最高的ETR蛋白，利用DNAMAN6.0軟件對這些蛋白序列進行相似性比對分析，采用MEGA4.02軟件的鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，并進行1000次Bootstrap檢驗。

1.2.5 果實內(nèi)源乙烯含量的測定 從授粉后第15至30d每隔5d，以及第30d后每隔1d，采摘甜瓜果實，并立即從果實內(nèi)腔中采集氣體樣品，水封法保存于小玻璃瓶內(nèi)，用氣相色譜儀測定乙烯含量，為保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可靠性，采樣在每天上午9時進行，重復(fù)3次。

1.2.6 定量PCR分析基因表達特性 用SYBR?Premix Ex TaqTM定量PCR試劑盒進行定量PCR檢測。反應(yīng)體系為：反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1μL，SYBR Premix Ex Taq（2×）12.5μL，上游引物（5μmol/L）1μL，下游引物（5μmol/L）1μL，加無菌超純水至總體積為25μL，混勻。用Opticon 3Real-time PCR System（Bio-Rad公司）進行分析，PCR擴增條件為：95℃預(yù)變性10s；95℃變性5s，60℃退火延伸20s，共進行40個循環(huán)。數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT方法進行分析，授粉后0d的甜瓜果實基因表達量設(shè)定為1，標(biāo)準(zhǔn)誤差（SEs）來自3個重復(fù)樣本。

2 結(jié)果

2.1 Cm-ETR1cDNA的 RT-PCR擴增

以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，PCR擴增后得到約2.2 kb的特異性條帶（圖1），與預(yù)期大小相符。

2.2 Cm-ETR1cDNA的克隆及序列分析

將PCR擴增得到的特異性條帶進行克隆，對重組克隆進行雙酶切鑒定（圖2）。為避免由于PCR擴增和序列分析造成的誤差，對3個獨立PCR擴增產(chǎn)物的重組克隆進行測序，并對其進行對比分析，獲得了Cm-ETR1cDNA序列（圖3）。結(jié)果表明，克隆的cDNA核苷酸序列長度為2256bp，編碼區(qū)長度為2223bp，編碼740個氨基酸組成的蛋白，其核苷酸序列（登錄號為EF495185）和推斷的氨基酸序列與已報道cantalupenis甜瓜的相應(yīng)序列完全相同。

圖1 PCR擴增產(chǎn)物

圖2 重組質(zhì)粒的酶切鑒定

2.3 Cm-ETR1與其他植物乙烯受體蛋白的相似性及系統(tǒng)進化樹分析

對Cm-ETR1與9個相似性最高的其他植物乙烯受體蛋白進行了序列比對分析。結(jié)果表明，Cm-ETR1與黃瓜乙烯受體蛋白的相似性最高（為99％），與龍眼乙烯受體蛋白的相似性最低（為86％）。系統(tǒng)進化樹分析表明（圖4），這10個乙烯受體蛋白首先聚類形成兩個分支，其中一個小分支由同屬的甜瓜和黃瓜乙烯受體蛋白組成，而大的分支則由龍眼、草莓、李、巴旦木、西洋梨、沙梨、蘋果和枇杷的乙烯受體蛋白組成。進行Bootstrap檢驗發(fā)現(xiàn)，除巴旦木及李的分支與西洋梨等的分支的Bootstrap值較低外，其他分支的Bootstrap值均大于90，說明應(yīng)用MEGA4.02軟件的NJ 法構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹較為可靠。

圖4 甜瓜Cm-ETR1蛋白的系統(tǒng)進化樹分析

2.4 甜瓜果實內(nèi)源乙烯含量測定

Excel軟件分析在甜瓜果實不同發(fā)育階段內(nèi)源乙烯含量變化。結(jié)果（圖5）顯示，在授粉后第40-41d出現(xiàn)了一個呼吸高峰，表現(xiàn)在乙烯含量的急劇增加。而乙烯峰值出現(xiàn)前后的發(fā)育階段乙烯釋放量較少，且變化幅度較小。河套蜜瓜果實這種乙烯合成方式符合典型的呼吸躍變型果實的內(nèi)源乙烯合成規(guī)律。

圖5 甜瓜果實內(nèi)源乙烯含量

2.5 甜瓜果實不同發(fā)育成熟階段Cm-ETR1基因的表達特性分析

定量PCR結(jié)果（圖6）顯示，在果實發(fā)育初期，Cm-ETR1基因轉(zhuǎn)錄水平較低且變化較小，在授粉后第35d，即果實內(nèi)源乙烯生成高峰前期，表達量顯著增加。在授粉后第40d，Cm-ETR1基因的表達水平達到最高值，約為授粉后第0d的5倍。隨后，Cm-ETR1基因表達水平顯著下降。

圖6 甜瓜果實發(fā)育成熟過程中Cm-ETR1基因的表達

3 討論

研究表明，乙烯受體基因家族的各成員在蛋白結(jié)構(gòu)和基因時空表達上各有其特點［8］。對擬南芥的研究表明，隨著乙烯合成能力的增強，ETR1的mRNA水平下降［9］。在番茄中ETR1是組成型表達的，其mRNA水平不受乙烯合成的影響［10］。在乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，乙烯受體各成員在功能上存在冗余性，但各成員對乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控能力不同。擬南芥ETR1功能喪失突變體ert1-7對乙烯更加敏感而且乙烯反應(yīng)更強烈，表明在乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中ETR1比其他乙烯受體發(fā)揮著更重要的作用［11］。擬南芥ETR1和ERS1基因雙突變體etr1-9；ers1-3的研究表明，與亞家族Ⅱ的3個成員相比，亞家族Ⅰ的ETR1和ERS1兩個成員在乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中具有更強烈的調(diào)控作用［12］。本研究從甜瓜品種河套蜜瓜成熟果實中克隆了乙烯受體亞家族Ⅰ成員ETR1基因Cm-ETR1的全長cDNA，對Cm-ETR1基因在甜瓜果實發(fā)育成熟過程中的表達特性進行了分析，Cm-ETR1基因的表達在授粉后第40d達到最高值，與乙烯峰幾乎同時出現(xiàn)，表明Cm-ETR1基因可能在乙烯誘導(dǎo)的甜瓜果實成熟及呼吸躍變過程中發(fā)揮重要作用。

4 結(jié)論

從典型的呼吸躍變型甜瓜品種河套蜜瓜中克隆了乙烯受體基因Cm-ETR1cDNA，其核苷酸序列及推斷的氨基酸序列與cantalupenis甜瓜的相應(yīng)序列完全一致。在該甜瓜果實發(fā)育和成熟過程中，內(nèi)源乙烯合成和Cm-ETR1基因的表達均呈單峰曲線，前者的峰值出現(xiàn)在授粉后第40-41d，而后者的峰值出現(xiàn)在授粉后第40d。Cm-ETR1基因的表達與果實發(fā)育成熟進程及乙烯合成呈顯著正相關(guān)。

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