劉志軍，楊瑞龍，楊 濤，胡敏棣，竇友義，張 謙，趙俊喜

中風(fēng)膏是在古方“佛手散（當(dāng)歸、川芎）”基礎(chǔ)上重用岷當(dāng)歸（達(dá)藥典規(guī)定的6倍），配伍赤芍、黃芪、水蛭、羌活和甘草等制成，具有活血化瘀及調(diào)節(jié)免疫功能的作用［1］，對中風(fēng)有良好臨床療效［2，3］。本研究旨在探討中風(fēng)膏對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及抗凋亡機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物、藥品和主要試劑 健康雌雄各半SPF級SD大鼠140只，體重280g～320g，鼠齡3～4個月。購于甘肅中醫(yī)學(xué)院科研實(shí)驗(yàn)中心，許可證號：SCXK（甘）2004－0006。

中風(fēng)膏為甘肅省中醫(yī)醫(yī)院院內(nèi)制劑，由醫(yī)院制劑室提供。藥品批文號：甘藥制字Z04000839，生產(chǎn)批號：20090412。配方：岷當(dāng)歸、川芎、赤芍、黃芪、水蛭、羌活、甘草等。工藝：將岷當(dāng)歸精餾后，取當(dāng)歸藥渣與川芎、赤芍、黃芪、水蛭、羌活、甘草混合，經(jīng)水提、醇沉、過濾、濃縮后與當(dāng)歸精餾產(chǎn)生的揮發(fā)油混合，滅菌制成膏劑，成品包裝。規(guī)格：10g。每克相當(dāng)于生藥9g（依據(jù)中華人民共和國藥典2000年版）。

脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的DNA原位末端標(biāo)記法（TUNEL），原位細(xì)胞凋亡檢測成套試劑盒由德國羅氏公司提供。2，3，5－三苯基四氮唑（TTC）由武漢博士德生物科技有限公司提供。

1.2 動物分組及處理 用數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（15只），模型組、中風(fēng)膏大劑量組、中風(fēng)膏小劑量組，各35只。除假手術(shù)組外，各組又分為TTC染色組及凋亡檢測組，TTC染色組再隨機(jī)分為缺血再灌注24h、48h及72h3個時間點(diǎn)，凋亡組隨機(jī)分為缺血再灌注4h、24h、48h和72h4個時間點(diǎn)，各個時間點(diǎn)5只。

給藥方法：中風(fēng)膏大、小劑量分別為1.8g／（kg·d）和0.9 g／（kg·d）。造模前連續(xù)灌胃7d及再灌注1h后灌胃給藥，每天上午、下午各一次；模型組每次予以同等容積生理鹽水灌胃。1.3 造模方法 參照Longa等［4］線栓造模方法并進(jìn)行部分改良建立大鼠右側(cè)腦缺血再灌注模型。手術(shù)分離右側(cè)頸總動脈（CCA）、頸外動脈（ECA）和頸內(nèi)動脈（ICA），結(jié)扎并切斷頸外動脈及其分支，電凝燒灼頸內(nèi)動脈顱外分支翼腭動脈，以阻斷顱外來源的側(cè)支循環(huán)。

動物模型成功的評價標(biāo)準(zhǔn)：手術(shù)后以大鼠清醒后出現(xiàn)同側(cè)Honer征（梗死灶同側(cè)瞳孔縮小，眼裂變，眼球內(nèi)陷）、自主運(yùn)動無方向性、提尾向右側(cè)旋轉(zhuǎn)、自行向右轉(zhuǎn)圈為判斷模型成功的標(biāo)準(zhǔn)。淘汰的大鼠隨機(jī)補(bǔ)充，保證每組5只。

1.4 標(biāo)本取材

1.4.1 TTC染色組大鼠腦標(biāo)本取材 腦缺血2h再灌注24h、48h、72h各時間點(diǎn)用10%水合氯醛（350mg／kg）麻醉大鼠后，沿胸骨旁線剪開胸腹腔，暴露心臟、肝臟及主動脈起始端，取灌注針自心尖向右上45度進(jìn)針至主動脈起始端，固定針頭，剪開右心耳，快速灌注生理鹽水（200～250）mL至肝臟變白，自右心耳流出的液體清亮后接著灌注4%多聚甲醛約300mL，先快后慢，至大鼠四肢強(qiáng)直僵硬后停止灌注，拔出穿刺針?？焖贁囝^取腦，置于10%多聚甲醛室溫下固定保存。

1.4.2 凋亡組大鼠大腦標(biāo)本取材 腦缺血2h再灌注4h、24 h、48h、72h各時間點(diǎn)用10%水合氯醛（350mg／kg）麻醉大鼠。打開胸腔，從左心室插入注射針頭，于右心耳部處剪一小口，向內(nèi)先快速滴入生理鹽水10min，然后緩慢滴入，至右心耳流出液變清亮，肝臟顏色變白為止。然后注入4%的多聚甲醛磷酸鹽緩沖液約250mL，灌流固定約30min，至肝臟變硬。用大剪刀沿大鼠頸部斷頭取腦，除去小腦和腦干，取視交叉前后20mm～30mm冠狀切片，放入10%甲醛中固定，24h內(nèi)石蠟包埋。

1.5 檢測指標(biāo)及方法

1.5.1 神經(jīng)功能缺損評分 參照 Longa［4］和 Bederon［5］的5分制評分方法標(biāo)準(zhǔn)，在缺血再灌注各時間點(diǎn)進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分。

1.5.2 TTC染色檢測腦梗死體積 將所取大腦置于－20℃冰箱中速凍20min，距額極3mm將大腦作連續(xù)2mm冠狀切片，共6片，然后將腦片放入2%TTC磷酸鹽緩沖液中，37℃恒溫孵育1h，轉(zhuǎn)入4%多聚甲醛中6h后觀察。應(yīng)用病理圖像分析儀測量腦梗死面積，根據(jù)公式 V＝（A1＋…An）t／2算出梗死體積。其中V為梗死體積，A為梗死面積，t為切片厚度。

1.5.3 脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的DNA原位末端標(biāo)記法（TUNEL）檢測細(xì)胞凋亡 將石蠟包埋標(biāo)本行連續(xù)冠狀切片，厚3μm，每20片取一片檢測細(xì)胞凋亡。光鏡下陽性細(xì)胞核染成棕黃色。每張切片在400倍光鏡下隨機(jī)選取5個不重疊的視野，計(jì)算陽性細(xì)胞數(shù)取平均值。

2 結(jié) 果

2.1 中風(fēng)膏對大鼠神經(jīng)功能缺損評分的影響 假手術(shù)組大鼠沒有神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)，評分均為0分。模型組、中風(fēng)膏大小劑量組均出現(xiàn)了不同程度的神經(jīng)功能缺損癥狀，神經(jīng)功能缺損評分隨時間推移而逐漸降低。在缺血再灌注24h后，藥物組神經(jīng)功能缺損評分均小于模型組（P＜0.05），但中風(fēng)膏大、小劑量組間差異不明顯。詳見表1。

表1 各組大鼠再灌注各時間點(diǎn)神經(jīng)缺損評分比較（±s） 分

表1 各組大鼠再灌注各時間點(diǎn)神經(jīng)缺損評分比較（±s） 分

組別 4h（n＝5） 24h（n＝10） 48h（n＝10） 72h（n＝10）假手術(shù)組0000模型組 2.56±0.55 2.78±0.63 2.12±0.73 1.57±0.68中風(fēng)膏小劑量組 2.54±0.57 1.98±0.551） 1.56±0.591） 0.93±0.521）中風(fēng)膏大劑量組 2.48±0.34 1.80±0.591） 1.44±0.521） 0.88±0.561）在相同時間點(diǎn)，與模型組組比較，1）P＜0.05

2.2 中風(fēng)膏對腦梗死體積的影響 假手術(shù)組無梗死灶。模型組隨缺血再灌注時間延長，腦梗死體積逐漸增加。缺血再灌注24h、48h、72h時間點(diǎn)，藥物組梗死體積均小于模型組（P＜0.05），但中風(fēng)膏大、小劑量間差異不明顯。詳見表2。

表2 各組大鼠再灌注各時間點(diǎn)腦梗死體積比較（±s） cm3

表2 各組大鼠再灌注各時間點(diǎn)腦梗死體積比較（±s） cm3

組別 n 24h 48h 72h假手術(shù)組5 0 0 0模型組 5 0.123 9±0.023 0 0.125 4±0.020 7 0.130 1±0.029 9中風(fēng)膏小劑量組 5 0.078 6±0.033 91） 0.073 2±0.021 71） 0.071 3±0.015 31）中風(fēng)膏大劑量組 5 0.073 5±0.037 11） 0.071 4±0.022 11） 0.066 1±0.020 91）在相同時間點(diǎn)，與模型組組比較，1）P＜0.05

2.3 中風(fēng)膏對細(xì)胞凋亡的影響 光鏡下正常細(xì)胞核呈藍(lán)色，凋亡細(xì)胞核為深淺不一的棕褐色。TUNEL法染色陽性的凋亡細(xì)胞主要位于額頂皮質(zhì)梗死灶與正常腦組織交界的周邊區(qū)。在假手術(shù)組凋亡細(xì)胞很少，藥物組和模型組凋亡細(xì)胞均顯著高于假手術(shù)組（P＜0.01）；缺血再灌注4h，凋亡細(xì)胞開始增多，24h達(dá)高峰，之后逐漸減少。藥物組與模型組相比，再灌注24h凋亡細(xì)胞明顯下降，并持續(xù)到再灌注72h（P＜0.05）。中風(fēng)膏大、小劑量組比較無明顯差異。詳見表3。

表3 各組大鼠再灌注各時間點(diǎn)凋亡細(xì)胞數(shù)比較（±s） 個／400倍視野

表3 各組大鼠再灌注各時間點(diǎn)凋亡細(xì)胞數(shù)比較（±s） 個／400倍視野

組別 n 4h 24h 48h 72h假手術(shù)組5 2.0±0.28 3.5±0.35 2.5±0.31 1.5±0.28模型組 5 7.6±0.421） 16.3±0.931） 12.7±0.671） 11.7±0.571）中風(fēng)膏小劑量組 5 7.4±0.401） 12.4±0.721）2） 9.5±0.731）2） 8.1±0.621）2）中風(fēng)膏大劑量組 5 7.3±0.451） 11.9±0.621）2） 8.8±0.621）2） 7.5±0.481）2）在相同時間點(diǎn)，與假手術(shù)組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05

3 討 論

急性腦缺血后由于腦組織缺血缺氧，產(chǎn)生一系列神經(jīng)功能缺損癥狀，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量，甚至生命。根據(jù)神經(jīng)功能缺損癥狀評分，可準(zhǔn)確評價藥物治療的效果及判斷患者的轉(zhuǎn)歸。因此，神經(jīng)功能缺損評分無論在臨床及動物實(shí)驗(yàn)中，被廣泛采用。Longa和Bederon的5分制評分方法是公認(rèn)的大鼠MACO模型神經(jīng)功能缺損癥狀評分方法。本研究假手術(shù)組僅僅將線栓插入大鼠頸內(nèi)動脈6mm，并未達(dá)到引起缺血的深度，所以沒有出現(xiàn)相應(yīng)的神經(jīng)癥狀，神經(jīng)學(xué)評分為0分，從而排除了手術(shù)因素對大鼠神經(jīng)學(xué)評分的影響。研究結(jié)果表明藥物分組因素、時間因素對大鼠的神經(jīng)學(xué)評分都能產(chǎn)生顯著的干預(yù)作用，模型組和給藥組（中風(fēng)膏大、小劑量組）出現(xiàn)了不同程度的神經(jīng)功能缺損癥狀，神經(jīng)功能缺損評分隨時間推移而逐漸降低。中風(fēng)膏能夠改善腦缺血再灌注大鼠的神經(jīng)損傷癥狀，在缺血再灌注24h后，給藥組神經(jīng)功能缺損評分均小于模型組（P＜0.05），但未顯示出量效關(guān)系。應(yīng)用MACO模型和TTC染色觀察腦梗死體積，是目前國內(nèi)外研究腦缺血再灌注損傷病理機(jī)制和評估藥效的常用方法。本研究結(jié)果顯示，假手術(shù)組無梗死灶；缺血再灌注24h、48h、72h時間點(diǎn)，藥物組梗死體積均小于模型組（P＜0.05），但未顯示出量效關(guān)系。中風(fēng)膏對腦缺血再灌注損傷有神經(jīng)保護(hù)作用。

在腦缺血急性期，神經(jīng)元壞死與凋亡并存，細(xì)胞壞死位于缺血中心區(qū)，細(xì)胞凋亡主要出現(xiàn)在缺血半暗帶。而在腦缺血的遲發(fā)性神經(jīng)元死亡期，則以細(xì)胞凋亡為主。凋亡可能決定了最終梗死體積［6］。本研究結(jié)果顯示，凋亡細(xì)胞主要位于梗死灶與正常腦組織交界的周邊區(qū)。在假手術(shù)組凋亡細(xì)胞很少，缺血再灌注模型組凋亡細(xì)胞顯著高于假手術(shù)組（P＜0.05）；缺血再灌注4h，凋亡細(xì)胞開始增多，24h達(dá)高峰，之后逐漸減少。提示中風(fēng)膏通過抑制缺血再灌注大鼠腦缺血區(qū)細(xì)胞凋亡，起到腦保護(hù)作用。

本實(shí)驗(yàn)更為全面深入闡明了中風(fēng)膏神經(jīng)保護(hù)作用及機(jī)制。但對其量效關(guān)系沒有明確的結(jié)論。另外，中風(fēng)膏抗凋亡路徑尚不清楚，這些問題需進(jìn)一步研究。

［1］黃正良，崔祝梅，任遠(yuǎn)，等.中風(fēng)膏的血液流變學(xué)與免疫功能的研究［J］.中成藥，1992，14（11）：31－33.

［2］夏永潮，徐文科，李妍怡，等.中風(fēng)膏治療中風(fēng)病臨床研究［J］.北京中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1993，16（5）：38－40.

［3］楊濤，劉志軍，李妍怡，等.中風(fēng)膏治療缺血性中風(fēng)的臨床研究［J］.中國中醫(yī)藥信息，2008，15（4）：80－84.

［4］Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，etal.Reversible middle cerebral artery occlusion without cranietomy in rats［J］.Stroke，1989，20（1）：84－91.

［5］Bederson JB，Pitts LH，Tsuji M，etal.Rat middle cerebralartery occlusion：Evaluation of the model and development of a neurologic examination［J］.Stroke，1986，17（3）：472－476.

［6］Faubel S，Edelstein CL.Caspases as drug targets in ischemic organ injury［J］.Curr Drug Targets Immune Endocr Metabol Disord，2005，5（3）：269－287.