李 陽 徐宗香 陳 曦 張鵬宇 潘 文

（1黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所，黑龍江齊齊哈爾 161006；2黑龍江省齊齊哈爾動物醫(yī)院，黑龍江齊齊哈爾 161006）

豬繁殖與呼吸綜合征高免血清的制備與臨床治療試驗

李 陽1徐宗香1陳 曦1張鵬宇2潘 文2

（1黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所，黑龍江齊齊哈爾 161006；2黑龍江省齊齊哈爾動物醫(yī)院，黑龍江齊齊哈爾 161006）

為篩選免疫效價高的疫苗，獲得高免血清并進(jìn)行臨床治療觀察。本試驗選用3種豬繁殖與呼吸綜合征疫苗免疫健康新西蘭大白兔，免疫后分別采血和分離血清，并用豬藍(lán)耳病毒抗體PPA-ELISA檢測試劑盒檢測血清抗體效價，篩選出抗體效價較高的兩種疫苗；免疫豬，制得高免血清對自然發(fā)病仔豬進(jìn)行高免血清治療試驗。免疫兔試驗表明，豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗（CH-lR株）免疫后血清抗體效價最低，高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗（HuN4-F112株）血清（簡稱高致病疫苗血清）抗體效價比豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗（CH-la株）血清（簡稱滅活疫苗血清）低，用后兩種疫苗免疫豬，血清抗體效價均能達(dá)到1∶1280。自然發(fā)病仔豬高免血清治療試驗顯示，注射高致病疫苗血清對藍(lán)耳病的治愈率為88%，滅活疫苗血清治愈率為76%。結(jié)果表明高免血清是無菌、安全的，所得兩種血清可用于臨床防治豬藍(lán)耳病。

豬繁殖與呼吸綜合征；疫苗；血清抗體效價；高免血清

豬繁殖與呼吸綜合征（P R R S），又稱豬藍(lán)耳病，是一種由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV） 引起的一種接觸性傳染病，各日齡豬只均可發(fā)病，1987年由美國首先報道[1]。該病以妊娠母豬流產(chǎn)、死產(chǎn)、產(chǎn)木乃伊胎和仔豬呼吸道癥狀為主要特征，傳染性強，危害性大，還可繼發(fā)感染其他疾病，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。由于病毒本身特性和機制，使其可逃避免疫系統(tǒng)的攻擊，延緩機體保護(hù)性抗體的產(chǎn)生，致使疫苗和藥物往往無法達(dá)到應(yīng)有的效果。

高免血清作為一種特異性抗體，能與體內(nèi)病毒發(fā)生特異性中和作用，從而抑制該病毒，臨床治療與疫苗聯(lián)合應(yīng)用可有效防治豬藍(lán)耳病，本研究篩選抗體效價較高的疫苗，制備豬藍(lán)耳病高免血清，并開展臨床治療試驗。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 商品疫苗

高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗（HuN4-F 112株，20頭份/瓶，批號：2012006）；豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗（C H-l a株，25頭份/瓶，批號：2011013）；豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗（C H-l R株，50mL/瓶，批號：2012002）。以上疫苗均由哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司生產(chǎn)。

1.1.2 試驗動物

5只健康幼齡豚鼠；10只健康新西蘭大白兔（體重2.5k g左右），均由黑龍江省齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。選取豬繁殖與呼吸綜合征潔凈豬場28～32日齡的健康長白仔豬，進(jìn)行E L I S A檢測，確定豬繁殖與呼吸綜合征抗體為陰性，任選4頭。齊齊哈爾市附近地區(qū)4個豬場已確診為自然發(fā)病的幼齡仔豬50頭。

1.1.3 試驗儀器和試劑

冷凍離心機（天津泰斯特儀器廠）；酶標(biāo)儀R a y t oR T-6000，全自動洗板機R a y t oR T-3100（深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司）。豬藍(lán)耳病毒抗體P P A-E L I S A檢測試劑盒（山東省綠都生物科技有限公司）；豬繁殖與呼吸綜合征病毒E L I S A抗體檢測試劑盒（武漢科前動物生物制品有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 試驗兔子免疫程序

將10只兔子分成3組（A組、B組、C組），每組3只兔子，另設(shè)一個陰性對照。首次免疫前采集空白兔血作為陰性對照。首次免疫：A組兔子，分別在背部皮下和腿部肌肉多點注射高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗2mL/只（疫苗說明書建議每頭仔豬接種1mL）；B組兔子，分別在頸部皮下和腿部肌肉多點注射豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗2mL/只（疫苗說明書建議每頭仔豬接種1mL）；C組兔子，分別在頸部皮下和腿部肌肉多點注射豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗2mL/只（疫苗說明書建議每頭仔豬接種1mL）。首次免疫后兩周以相同方式進(jìn)行二次免疫，每只兔子注射4mL。二次免疫后兩周以相同方式進(jìn)行三次免疫，每只兔子注射8mL。相隔兩周后進(jìn)行第四次免疫，每只兔子注射12mL。每次免疫，按相同方法給對照試驗兔子注射與免疫劑量相同的生理鹽水。

1.2.2 試驗豬免疫程序

在首次免疫前采集空白豬血樣作陰性對照。根據(jù)兔免疫試驗結(jié)果，將試驗豬分成兩組（一組、二組）。首次免疫，一組豬于頸部肌肉注射高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗2mL/頭；二組豬頸部肌肉注射豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗2mL/頭。首次免疫后兩周以相同方式進(jìn)行二次免疫，每頭豬注射4mL。間隔兩周后以相同方式進(jìn)行三次免疫，每頭豬注射8mL。間隔兩周后進(jìn)行第四次免疫，每頭豬注射12mL。

表1 兔血清抗體效價檢測

表2 注射高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗的豬抗體效價

1.2.3 高免血清的制備和安全性試驗

每次免疫試驗前試驗豬少量采血檢測其抗體效價。當(dāng)檢測豬血清抗體效價達(dá)到要求時，對豬進(jìn)行前腔靜脈采血，采得的血液均用自然凝結(jié)法分離血清，加入雙抗（每毫升各加1000U的青霉素、鏈霉素）和0.01%的硫柳汞，部分少量分裝。隨機抽取自制的血清樣品，分別接種于普通瓊脂平板、S.S瓊脂和血平板中，37℃培養(yǎng)48小時。同時將自制血清樣品，分別給5只健康幼齡豚鼠進(jìn)行皮下注射1mL，觀察豚鼠反應(yīng)。

1.2.4 高免血清E L I S A效價的檢測

（1） 兔血清抗體檢測

試驗兔最后一次免疫2周，用兔心臟采血法（之前均用耳緣靜脈采血法）自然凝結(jié)分離血清。兔血清效價檢測用豬藍(lán)耳病毒抗體P P A-E L I S A檢測試劑盒，該試劑盒是專門針對兔血清的檢測試劑盒。參照試劑盒說明書，陰性對照孔 O D450≤0.2，陽性對照孔 O D450≥0.4，試驗成立；臨界值=0.18+陰性對照均值，樣品O D450值≥臨界值判定為陽性，樣品O D450＜臨界值為陰性。結(jié)果見表1。

（2） 豬血清抗體檢測

試驗豬最后一次免疫2周，對豬進(jìn)行前腔靜脈采血，自然凝結(jié)分離血清，將血清從1∶40倍比稀釋至1∶5120。參照試劑盒說明書，陽性對照孔O D630≥0.7，陰性對照孔 O D630＜0.3，試驗成立；K Q值=樣品O D630值×100／陽性對照O D630平均值，K Q≥20的樣品為陽性，K Q＜20的為陰性。結(jié)果見表2和表3。

1.2.5 臨床治療試驗

在齊齊哈爾市周邊地區(qū)的4個豬場，選擇自然發(fā)病的仔豬50頭，平均分兩組，分別注射高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗免疫制備的豬血清和豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗免疫制備的豬血清。根據(jù)體重每頭豬注射3～5mL高免血清，24小時未痊愈的，相同劑量再注射一次。

2 結(jié)果

2.1 疫苗免疫效價

試驗對兔子分別用3種疫苗免疫，由表1可知，相同免疫次數(shù)和劑量的條件下，C組豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗抗體效價最高，其次是A組高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗，B組試驗中注射豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗的兔血清抗體效價上升最慢，對照組血清效價沒有變化。這里選用效價較高的兩種疫苗對豬進(jìn)行免疫。

分別對試驗豬注射高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗和豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗兩種疫苗，最后一次免疫后，血清E L I S A抗體檢測結(jié)果（表2和表3），按照試劑盒說明方法換算，血清倍比稀釋到1∶1280時兩種疫苗血清均為陽性，在相同稀釋條件下豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗血清效價要稍高些。

表3 注射豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗的豬抗體效價

2.2 血清無菌性試驗和安全性試驗結(jié)果

高免血清細(xì)菌培養(yǎng)均無細(xì)菌生長。血清注射豚鼠后觀察3天，豚鼠均健康，無異常表現(xiàn)。

2.3 治療效果觀察

發(fā)病仔豬表現(xiàn)呼吸困難、厭食、發(fā)熱、眼瞼水腫、打噴嚏、耳紫和軀體末端皮膚發(fā)紺等癥狀，從開始治療后3天，以上癥狀明顯減退或消失，沒有死亡現(xiàn)象，判為治愈，否則判為無效。給25頭發(fā)病仔豬注射高致病疫苗血清，22頭豬臨床癥狀消失，治愈率為88%。注射滅活疫苗血清的25頭豬中，1頭豬死亡，臨床表現(xiàn)上19頭豬恢復(fù)正常，治愈率為76%。

3 討論與分析

由于病毒發(fā)生變異，細(xì)菌毒力增強，且逐漸呈現(xiàn)非典型性，給豬病的診斷和治療帶來很大難度。豬繁殖與呼吸綜合征屬于免疫抑制性疾病，極易與豬瘟和豬圓環(huán)病毒發(fā)生混合感染，還容易繼發(fā)多種細(xì)菌性疾病，使得疫苗和藥物治療往往不能達(dá)到理想的效果。對于規(guī)?；B(yǎng)豬場在疫病緊急控制方面，使用高免血清是比較有效的措施之一。目前市售的豬藍(lán)耳病商品化血清極少，質(zhì)量參差不齊。

由于目前還沒有關(guān)于豬繁殖與呼吸綜合征血清制備的標(biāo)準(zhǔn)，因此本試驗是在有關(guān)文獻(xiàn)報道的基礎(chǔ)上開展的[2-4]。本試驗旨在制備由高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗免疫的血清，選用黑龍江地區(qū)經(jīng)常使用的豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗（C H-l R株） 和豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗（C H-l a株）作為對比試驗，但在免疫兔試驗中發(fā)現(xiàn)豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗（C H-l R株） 抗體效價最低，且豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗血清效價高于高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗血清，因此在制備高免血清的試驗中用效價較高的兩種疫苗免疫試驗豬，結(jié)果，滅活疫苗血清效價仍然較高，但對兩種高免血清治療效果的觀察來看，高致病疫苗血清治愈率要稍高一些。分析原因如下：首先，可能由于疫苗佐劑的不同，本試驗中油佐劑滅活疫苗產(chǎn)生抗體效價更高；其次，兩種疫苗所用毒株不同，一個是高致病型，一個是經(jīng)典型，臨床試驗結(jié)果表明目前藍(lán)耳病流行以高致病性藍(lán)耳病居多。產(chǎn)生以上現(xiàn)象的原因還需要進(jìn)一步試驗論證。

本實驗的臨床治愈率并沒有報道的那樣高，一方面是由于個別豬的病程較長，即便使用血清治療，效果還是不佳，因此本病應(yīng)該及早發(fā)現(xiàn)及早治療；另一方面，病豬并非單純感染豬繁殖與呼吸綜合征病毒，而是同時感染了其他病菌，影響了多價、高效血清的治愈效果。另外，同時或在較短時間間隔內(nèi)注射兩種或兩種以上疫苗，往往會影響血清抗體水平，例如，豬瘟、豬藍(lán)耳病和豬口蹄疫疫苗的免疫[5,6]，因此，制定合理的免疫程序是制備高免血清的一個關(guān)鍵。本研究中制備的高免血清對于臨床治療是有效果的，對仔豬也沒有產(chǎn)生不良反應(yīng)。因此，制備高效價、多聯(lián)的高免血清是我們下一步要研究的重要內(nèi)容。

[1] Wensvoort G, TerpstraC, Pol JMA,et al. Mystery swine disease in the Netherlands:the isolation of Lelystad virus. Vet Q,1991, 13: 121-130.

[2]郭一,陳潔,金爾光,等.豬瘟—豬藍(lán)耳病—豬圓環(huán)2型三聯(lián)高免血清的制備.湖北畜牧獸醫(yī),2011(11):6-7.

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[5]張長龍，嚴(yán)寶英，賈文孝,等.豬瘟、豬口蹄疫、高致病性豬藍(lán)耳病疫苗免疫試驗初探.動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2009(7):101-103.

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2013-05-15