楊成德， 陳秀蓉＊， 姜紅霞， 薛 莉， 蒲崇建， 張正偉

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室中－美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，蘭州 730070；2.甘肅省植保植檢站，蘭州 730020）

馬鈴薯（Solanum tuberosumLinn.）的種植幾乎遍及全球，一方面解決了糧食短缺問題，另一方面也帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)效益。據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（FAO）統(tǒng)計(jì)，馬鈴薯總產(chǎn)量在全世界所有糧食作物中位于第四，國(guó)內(nèi)內(nèi)蒙古、東北三省及甘肅等地區(qū)均有大面積種植。新鮮馬鈴薯中含有淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪和粗纖維，且含有禾谷類糧食所沒有的胡蘿卜素和抗壞血酸等，可作主食，也可作為蔬菜、釀造酒或作為飼料。甘肅省87個(gè)縣（市、區(qū)）中有60個(gè)縣種植馬鈴薯，甘肅定西有著“馬鈴薯之鄉(xiāng)”之稱，馬鈴薯是當(dāng)?shù)剞r(nóng)民的主要經(jīng)濟(jì)來源，也是該地區(qū)發(fā)展經(jīng)濟(jì)的支柱產(chǎn)業(yè)之一。但是，近年來馬鈴薯在生產(chǎn)及儲(chǔ)藏過程中炭疽病發(fā)生日趨嚴(yán)重，已成為甘肅省馬鈴薯生產(chǎn)及儲(chǔ)藏中的主要病害之一，嚴(yán)重影響其儲(chǔ)藏時(shí)間和品質(zhì)［1］。馬鈴薯炭疽病的研究可以追溯到20世紀(jì)初，目前該病廣泛分布于美國(guó)、日本和加拿大等50多個(gè)國(guó)家和地區(qū)［2］。該菌可以侵染馬鈴薯的各個(gè)生長(zhǎng)部位［3］，侵染根部引起根腐爛，侵染維管束造成萎蔫，嚴(yán)重時(shí)引起植株枯萎［1］。據(jù)Tsror等［4］報(bào)道，該病害可使產(chǎn)量減少22%～30%，且塊莖品質(zhì)也大受影響。據(jù)調(diào)查，馬鈴薯炭疽病在甘肅省武都、天祝和定西等地發(fā)生較重，楊成德等［1］對(duì)該病害的癥狀、病原及室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果進(jìn)行了報(bào)道，但有關(guān)病原菌生物學(xué)特性及營(yíng)養(yǎng)利用能力等方面的研究未見報(bào)道。因此，作者對(duì)該病原菌的生物學(xué)特性和營(yíng)養(yǎng)利用（碳源、氮源）能力等進(jìn)行了研究，以期為掌握該病害的發(fā)生規(guī)律和制定綜合防治措施提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試菌種：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)病理實(shí)驗(yàn)室保存的馬鈴薯炭 疽 病 菌 ［Colletotrichum coccodes （Wallr.）Hughes］。

培養(yǎng)基：選用馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基）、馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基（PSA培養(yǎng)基）、虎紅瓊脂培養(yǎng)基、燕麥片培養(yǎng)基、玉米粉培養(yǎng)基、査理固體培養(yǎng)基、查彼固體培養(yǎng)基、麥芽糖培養(yǎng)基、麥芽瓊脂培養(yǎng)基和水瓊脂培養(yǎng)基，參考文獻(xiàn)［5］進(jìn)行配制。

1.2 方法

1.2.1 生物學(xué)特性研究

1.2.1.1 溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

采用生長(zhǎng)速率法。將病原菌接種于PDA平板中央，分別置于溫度為5、10、15、20、25、30、35和40℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3次重復(fù)，3d后每隔1d用十字交叉法測(cè)定菌落直徑并描述菌落形態(tài)特征，直至生長(zhǎng)最快溫度下滿皿。

1.2.1.2 溫度、濕度和pH對(duì)分生孢子萌發(fā)的影響

具體方法參考文獻(xiàn)［6］進(jìn)行，即在干燥器內(nèi)用硫酸法控制濕度，將孢子粉撒于載玻片上，設(shè)置相對(duì)濕度99%、95%、90%、85%和液態(tài)水5個(gè)處理，室溫下培養(yǎng)24h后挑取各處理的孢子，無菌水制片，立即檢查孢子萌發(fā)率，3次重復(fù)，鏡檢不少于10個(gè)視野，100個(gè)孢子，并計(jì)算孢子萌發(fā)率。

1.2.1.3 浸提液對(duì)孢子萌發(fā)的影響

配制各種浸提液（土壤浸提液，馬鈴薯幼苗期根、莖、葉浸提液，薯塊浸提液，其中水∶浸提液＝1∶10）懸滴法測(cè)定孢子萌發(fā)率，其他同1.2.1.2。

1.2.1.4 光照對(duì)孢子萌發(fā)的影響

用無菌水配制孢子懸浮液，懸滴法制片，置于全光照和全黑暗條件下處理，其他同1.2.1.2。

1.2.2 培養(yǎng)性狀研究

1.2.2.1 碳源和氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

采用生長(zhǎng)速率法，即將PDA平板上活化后的病原菌用直徑0.4cm的打孔器取菌餅，取1塊置于加1.5%不同碳源或加0.25%不同氮源的馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基中央，最適溫度下培養(yǎng)，3d后每隔1d用十字交叉法測(cè)定菌落直徑并描述菌落特征，直至生長(zhǎng)最快碳源或氮源滿皿。具體碳源和氮源種類分別見圖7和圖9，以不加任何碳源或氮源的培養(yǎng)基為對(duì)照，具體方法參考文獻(xiàn)［7］進(jìn)行。

1.2.2.2 培養(yǎng)基對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

采用生長(zhǎng)速率法。將經(jīng)PDA平板活化的病原菌用0.4cm直徑的打孔器切取菌餅，取1塊置于10種培養(yǎng)基（具體培養(yǎng)基種類見圖9）中央，其他同1.2.2.1。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物學(xué)特性研究

2.1.1 溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

馬鈴薯炭疽病菌在5～40℃范圍內(nèi)均可生長(zhǎng)，小于15℃和高于35℃時(shí)菌絲生長(zhǎng)緩慢，25～35℃為較適宜溫度范圍，其菌落直徑顯著高于其他生長(zhǎng)溫度（P＜0.05），30℃為最適生長(zhǎng)溫度（圖1），此時(shí)在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7d菌落直徑為7.58cm，且有大量分生孢子盤形成，菌落質(zhì)地均勻，表面有不明顯輪紋，無色素產(chǎn)生，無特殊氣味，菌落邊緣整齊且著生絮狀菌絲，偶有扇形突變。

圖1 溫度對(duì)馬鈴薯炭疽病菌菌絲生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effects of temperature on colony growth of C.coccodes

2.1.2 溫度對(duì)分生孢子萌發(fā)的影響

分生孢子在5～40℃內(nèi)均可萌發(fā)，20～30℃萌發(fā)率較高，25℃為最適萌發(fā)溫度，萌發(fā)率顯著高于其他溫度（P＜0.05），在溫度低于5℃和高于40℃時(shí)分生孢子不萌發(fā)，在5～25℃條件下，隨溫度升高，孢子萌發(fā)率隨之增大，當(dāng)溫度高于25℃時(shí)，孢子萌發(fā)率隨溫度升高而呈現(xiàn)顯著下降趨勢(shì)（圖2）。

圖2 溫度對(duì)馬鈴薯炭疽病菌孢子萌發(fā)的影響Fig.2 Effects of temperature on conidial germination of C.coccodes

2.1.3 濕度對(duì)分生孢子萌發(fā)的影響

分生孢子在液態(tài)水中萌發(fā)率最高，達(dá)93.33%，顯著高于其他濕度條件（P＜0.05），在相對(duì)濕度99%時(shí)萌發(fā)率為18.95%，相對(duì)濕度為85%時(shí)萌發(fā)率僅為8.00%，即隨著相對(duì)濕度的下降孢子萌發(fā)率也顯著下降，該結(jié)果說明高濕度是該分生孢子萌發(fā)的必要條件，且液態(tài)水為該分生孢子萌發(fā)的最適濕度條件（圖3）。

圖3 濕度對(duì)馬鈴薯炭疽病菌孢子萌發(fā)的影響Fig.3 Effects of relative humidity on conidial germination of C.coccodes

2.1.4 pH對(duì)分生孢子萌發(fā)的影響

分生孢子在供試的pH范圍內(nèi)均可萌發(fā)，但在pH6.47～7.38范圍內(nèi)較高，且在pH6.7時(shí)其萌發(fā)率顯著高于其他pH條件（P＜0.05），說明pH對(duì)該分生孢子萌發(fā)影響明顯，但中性較適合該孢子萌發(fā)（圖4）。

圖4 pH對(duì)馬鈴薯炭疽病菌孢子萌發(fā)的影響Fig.4 Effects of pH value on conidial germination of C.coccodes

2.1.5 浸提液對(duì)分生孢子萌發(fā)的影響

分生孢子在薯塊浸提液中萌發(fā)率顯著高于葉、莖、根或土壤浸提液（P＜0.05），根浸提液萌發(fā)率顯著低于其他浸提液（P＜0.05）（圖5）。該結(jié)果說明薯塊中的化學(xué)物質(zhì)對(duì)孢子萌發(fā)有促進(jìn)作用，分生孢子在薯塊上容易萌發(fā)，而根較其他器官則不利于分生孢子的萌發(fā)。

圖5 營(yíng)養(yǎng)液對(duì)馬鈴薯炭疽病菌孢子萌發(fā)的影響Fig.5 Effects of the extracts on conidial germination of C.coccodes

2.1.6 光照對(duì)孢子萌發(fā)的影響

在全光照條件下分生孢子萌發(fā)率略高于全黑暗條件，但差異不顯著（圖6），表明該分生孢子萌發(fā)對(duì)光不敏感，在有無光照條件下均能萌發(fā)。

圖6 光照對(duì)馬鈴薯炭疽病菌孢子萌發(fā)的影響Fig.6 Effects of light on conidial germination of C.coccodes

2.2 培養(yǎng)性狀研究

2.2.1 碳源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

馬鈴薯炭疽菌對(duì)各種碳源均有較好的利用能力，菌絲生長(zhǎng)良好，除D－阿拉伯糖和氯醛糖外菌落直徑均顯著高于對(duì)照（P＜0.05），對(duì)菌絲生長(zhǎng)有明顯促進(jìn)作用，但以氯醛糖為碳源時(shí)菌落直徑顯著小于對(duì)照（P＜0.05），對(duì)菌絲生長(zhǎng)有抑制作用。該結(jié)果說明此菌對(duì)碳源要求不嚴(yán)格，能利用多種碳源，但利用能力有差異，利用能力高低依次為蔗糖＞葡萄糖＞甘露糖＞D－木糖＞麥芽糖＞D－半乳糖＞乳糖＞D－果糖＞可溶性淀粉＞D－阿拉伯糖＞氯醛糖。

圖7 碳源對(duì)馬鈴薯炭疽病菌菌絲生長(zhǎng)的影響Fig.7 Effects of carbon sources on colony growth of C.coccodes

2.2.2 不同碳源培養(yǎng)基上菌落特征

馬鈴薯炭疽病菌在葡萄糖培養(yǎng)基上菌落黑褐色，輪紋明顯，表面平鋪，質(zhì)密，邊緣整齊，菌絲絮狀，無特殊氣味和色素產(chǎn)生（圖8a）；在D－阿拉伯糖和D－半乳糖培養(yǎng)基上菌絲茂密，產(chǎn)生淡褐色非水溶性色素，邊緣不整齊，呈折扇狀（圖8b）。在乳糖培養(yǎng)基上菌體質(zhì)密，菌絲發(fā)達(dá)，分生孢子盤及產(chǎn)孢量大，菌落表面光滑；在D－果糖培養(yǎng)基上菌落輪紋明顯，顏色較深，分生孢子盤呈放射狀排列，無色素，無特殊氣味產(chǎn)生（圖8c）；在其余碳源培養(yǎng)基上菌落形態(tài)與葡萄糖培養(yǎng)基上基本相似。在對(duì)照培養(yǎng)基上分生孢子盤小且密生，菌落顏色淺，菌絲絮狀發(fā)達(dá)，表面光滑。

2.2.3 氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

硝酸銨對(duì)炭疽菌生長(zhǎng)有顯著促進(jìn)作用（P＜0.05），在以氯化銨為氮源的培養(yǎng)基上炭疽菌生長(zhǎng)較對(duì)照快，但差異不顯著（P＞0.05），其他供試氮源均不利于該菌生長(zhǎng)，且在碳酸銨、L－谷氨酸、尿素、大豆蛋白胨、L－組氨酸、L－精氨酸、亮氨酸、蛋白胨和甘氨酸為氮源的培養(yǎng)基上差異顯著（P＜0.05）（圖9）。該結(jié)果說明馬鈴薯炭疽病菌可以利用多種氮源，但對(duì)不同氮源的利用能力有差異。

圖8 碳源培養(yǎng)基上馬鈴薯炭疽病菌菌落特征Fig.8 The colony characteristics of C.coccodes on C－source media

2.2.4 氮源培養(yǎng)基上的菌落特征

在對(duì)照培養(yǎng)基上菌落輪紋明顯，菌絲生長(zhǎng)旺盛，菌落顏色深，表面光滑，邊緣整齊，無色素產(chǎn)生，分生孢子盤小且密，產(chǎn)孢量大；在硝酸鈉、L－組氨酸、L－精氨酸、亮氨酸和L－谷氨酸培養(yǎng)基上輪紋不明顯，菌絲生長(zhǎng)旺盛，菌落表面光滑，產(chǎn)孢量較大（圖10a）；在氯化銨、硝酸銨、碳酸銨和尿素培養(yǎng)基上菌絲發(fā)達(dá)呈絮狀，分生孢子盤小而密，無色素產(chǎn)生，有特殊氣味，分生孢子盤大，產(chǎn)孢量大，但在尿素培養(yǎng)基上菌落輪紋明顯，而其他氮源培養(yǎng)基上輪紋不明顯；在大豆蛋白胨培養(yǎng)基上菌落顏色深，菌絲發(fā)達(dá)呈絮狀，分生孢子盤小而密，無色素產(chǎn)生，有特殊氣味，產(chǎn)孢量大（圖10b）；在蛋白胨培養(yǎng)基上菌落輪紋明顯呈深淺相間的同心圓，菌絲發(fā)達(dá)呈絮狀，分生孢子盤小而密，無色素產(chǎn)生，有特殊氣味，產(chǎn)孢量大；在甘氨酸培養(yǎng)基上菌落輪紋明顯呈兩個(gè)同心圓狀，邊緣菌絲顏色淡，中央顏色深，分生孢子盤小而密，無色素產(chǎn)生，有特殊氣味，產(chǎn)孢量大（圖10c）。

圖9 氮源對(duì)馬鈴薯炭疽病菌菌絲生長(zhǎng)的影響Fig.9 Effects of N－source on colony growth of C.coccodes

圖10 氮源培養(yǎng)基上馬鈴薯炭疽病菌菌落特征Fig.10 The colony characteristics of C.coccodes on N－source media

2.2.5 不同培養(yǎng)基對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

馬鈴薯炭疽菌在PDA和麥芽汁培養(yǎng)基上菌落直徑顯著高于其他培養(yǎng)基（P＜0.05），而在玉米粉及水瓊脂上顯著小于其他培養(yǎng)基（P＜0.05）。該菌在馬丁氏培養(yǎng)基上菌落邊緣整齊，表面光滑，菌絲發(fā)達(dá)，菌落中央顏色略深，邊緣較淡，分生孢子盤少；玉米粉培養(yǎng)基上菌落輪紋明顯，表面粗糙，有淡褐色水溶性色素產(chǎn)生；麥芽糖和麥芽汁培養(yǎng)基上菌落輪紋明顯，無特殊氣味，有淡褐色水溶性色素產(chǎn)生，菌絲發(fā)達(dá)，有較多分生孢子盤形成（圖12a）；燕麥片和查彼培養(yǎng)基上菌落輪紋不明顯，表面光滑，無色素產(chǎn)生，有無色氣生菌絲產(chǎn)生，菌落近透明，有較多分生孢子盤形成（圖12b）；查理培養(yǎng)基上菌落輪紋不明顯，表面粗糙，有橘紅色非水溶性色素產(chǎn)生，無分生孢子盤產(chǎn)生（圖12c）；PDA和PSA培養(yǎng)基上菌絲顏色淡，無同心輪紋，無色素產(chǎn)生，有無色氣生菌絲產(chǎn)生，菌落近透明，有較多分生孢子盤形成；水瓊脂培養(yǎng)基上菌落輪紋不明顯，表面光滑，邊緣整齊，無色素產(chǎn)生，氣生菌絲少，菌落近透明，分生孢子盤少。

圖11 培養(yǎng)基對(duì)馬鈴薯炭疽病菌菌絲生長(zhǎng)的影響Fig.11 Effects of medium on colony growth of C.coccodes

圖12 不同培養(yǎng)基上的馬鈴薯炭疽病菌菌落特征Fig.12 The colony characteristics of C.coccodes on different media

3 討論與結(jié)論

已研究報(bào)道的馬鈴薯病害有幾十種［8］，但報(bào)道較多的是馬鈴薯晚疫病、病毒?。≒VX和PVY）、軟腐病、環(huán)腐病和黑脛病等在生產(chǎn)中較常見的病害，對(duì)這些病害的病原學(xué)、發(fā)生規(guī)律及防治技術(shù)等均有較系統(tǒng)的 研 究［9－11］。 許 多 研 究 者［12－13］認(rèn) 為，生 長(zhǎng) 期 病原菌危害薯塊，造成薯塊帶菌或潛伏侵染后，在貯藏期條件適宜時(shí)引起薯塊腐爛，如馬鈴薯塊莖干腐病、馬鈴薯晚疫病和馬鈴薯環(huán)腐病等薯塊帶菌均可引起貯藏期薯塊腐爛。馬鈴薯炭疽病也為生長(zhǎng)期和貯藏期均發(fā)生的重要病害之一，但國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)較少。因此，本試驗(yàn)研究了該病原菌的生物學(xué)特性，結(jié)果表明，該病原菌菌絲在20～30℃生長(zhǎng)較快，30℃為最適生長(zhǎng)溫度，與文獻(xiàn)［14］報(bào)道一致；該菌分生孢子最適萌發(fā)溫度為25℃，5℃時(shí)分生孢子不萌發(fā)，與文獻(xiàn)報(bào)道［14］一致；分生孢子在液態(tài)水中萌發(fā)率最高，達(dá)93.33%，隨著相對(duì)濕度下降萌發(fā)率也下降，說明高濕有利于分生孢子萌發(fā)；分生孢子在pH6.7時(shí)萌發(fā)率最高，與文獻(xiàn)報(bào)道一致［14］；分生孢子萌發(fā)對(duì)光不敏感，在有、無光照條件下都能萌發(fā)。在薯塊浸提液中萌發(fā)率最高，而在根、莖、葉浸提液中萌發(fā)率很低，此可能由于本試驗(yàn)所選用的是馬鈴薯幼苗期根、莖和葉，是否幼苗期根、莖和葉比成熟期抗病還需進(jìn)一步研究。該病原菌可以廣泛利用碳、氮源，并且在不同培養(yǎng)基上菌落形態(tài)、產(chǎn)孢能力及生長(zhǎng)速率不同，說明該菌對(duì)不同營(yíng)養(yǎng)的利用能力有差異，這些差異能否用來對(duì)該菌進(jìn)行分類或在病害綜合防治中應(yīng)用還須進(jìn)一步研究。本試驗(yàn)較詳細(xì)地報(bào)道了馬鈴薯炭疽病菌的生物學(xué)特性及對(duì)不同碳、氮源的利用能力等，可為了解該病害的發(fā)生規(guī)律及制定綜合控制措施提供依據(jù)。

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