于彩虹， 黃 瑩， 林榮華， 姜 輝， 王文濤， 裴 力

（1.中國礦業(yè)大學(xué) （北京）化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，北京 100083；2.農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所環(huán)境室，北京 100125）

海藻糖（α－D－吡喃葡糖基－α－D－吡喃葡萄糖苷），由兩分子葡萄糖依靠α－1，1糖苷鍵連接形成的二糖，不同于哺乳動物中的葡萄糖和植物中的蔗糖，它是所有昆蟲的主要血糖，是主要的產(chǎn)能物質(zhì)和大分子合成基礎(chǔ)［1－2］。由于海藻糖不能跨膜運輸，因此被細(xì)胞利用前必須要先轉(zhuǎn)化為葡萄糖［2］。海藻糖水解酶，又稱海藻糖酶，國際酶學(xué)編號為（EC 3.2.1.28），是昆蟲當(dāng)中存在的唯一能夠水解1分子海藻糖為2分子葡萄糖的酶類，而葡萄糖最終作為昆蟲細(xì)胞進(jìn)行糖酵解的原料。在昆蟲中，利用糖作為能量的來源（如飛行或滲透調(diào)節(jié)）都是由海藻糖酶來調(diào)控的。除此之外，海藻糖酶對海藻糖的代謝與昆蟲的越冬、滯育、幾丁質(zhì)的合成以及物種的擴(kuò)張和競爭適應(yīng)都有作用［3－6］。本研究選取國內(nèi)外沒有研究的我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上5種重要害蟲：亞洲玉米螟［Ostrinia furnacalis （Guenée）］、黏 蟲 ［Mythimna separata（Walker）］、棉 鈴 蟲 ［Helicoverpa armigera（Hübner）］、小菜蛾［Plutella xylostella （Linnae－us 和甜菜夜蛾［Spodoptera exiguaHübner 為對象，比較研究了不同發(fā)育期的幼蟲以及5齡幼蟲不同組織部位中可溶性海藻糖酶的活性和分布情況，為進(jìn)一步的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試?yán)ハx：黏蟲在室溫（23±1）℃，相對濕度70%～80%，光周期L∥D＝16h∥8h條件下采用新鮮玉米苗飼養(yǎng)。小菜蛾室內(nèi)飼養(yǎng)采用蛭石蘿卜苗法。棉鈴蟲、亞洲玉米螟和甜菜夜蛾均為室內(nèi)人工飼料飼養(yǎng)。棉鈴蟲在溫度（26±1）℃，相對濕度70%～80%，光照L∥D＝16h∥8h完全人工飼料連續(xù)飼養(yǎng)［7－11］。

試劑：苯基硫脲（PTU）、牛血清白蛋白、考馬斯亮藍(lán)G－250、檸檬酸購自Sigma公司，葡萄糖測定試劑盒——GLU（液體試劑）從北京利德曼生化技術(shù)公司購得，海藻糖及其他常規(guī)化學(xué)試劑購自北京市化學(xué)試劑公司。

1.2 方法

1.2.1 幼蟲不同組織的分離

血淋巴的提?。簩⒂紫x先用水沖洗并用濾紙吸凈，再將其放在冰上冰凍15min以麻醉昆蟲，末端體節(jié)切開小口，用10μL移液槍的干凈槍頭擠壓昆蟲，將血淋巴吸到裝有10μL飽和苯基硫脲（PTU）5mmol／L溶液中，防止血淋巴變黑。血淋巴在4℃下，9000×g離心10min，則海藻糖酶主要存在于上清液中［12－13］。

其他組織的分離：將幼蟲置于冰盤上固定后，用解剖剪將其從腹部末端向前剖開，先用小型消毒鑷子直接將馬氏管取出，放到預(yù)冷的裝有緩沖液的離心管中，置于超低溫冰箱中備用；分離腸道時先將整個腸道全部取出，將腸道內(nèi)的由圍食膜包裹的食物剔除，分別取出前腸、后腸和中腸部分放到預(yù)冷的1.15%的KCl溶液中漂洗和透析，以除去其中從食物中攝入的過量蔗糖。透析一段時間再將前、中、后腸取出放到裝有預(yù)冷緩沖液的離心管中，置于超低溫冰箱中備用；將解剖后，去除以上3個部分后的幼蟲，置于冰盤上，用消毒的解剖刀輕輕刮下體壁附著及游離的白色脂肪，將其放到裝有預(yù)冷的緩沖液的離心管中，置于超低溫冰箱中備用；以上四步完成后，用解剖刀進(jìn)一步刮除殘留的脂肪等物，用鑷子將體壁于定性濾紙上搓揉，以徹底去除脂肪等殘余物。最后將干凈的體壁放到預(yù)冷的離心管中，置于超低溫冰箱中備用。

1.2.2 海藻糖酶液的制備

昆蟲卵、1齡、2齡、3齡、4齡幼蟲直接從冰箱取出融化后，先用預(yù)冷的125mmol／L NaCl溶液洗凈，并用濾紙吸干。加入一定體積的緩沖液于組織勻漿器中勻漿后，在4℃下10800×g離心30min，取上清液備用。

5齡幼蟲的中腸組織、馬氏管、脂肪體和體壁用預(yù)冷的緩沖液在組織勻漿器中勻漿，反復(fù)凍融3次，在4℃下10800×g離心30min，取上清液備用。血淋巴在4℃下9000×g離心10min，取上清液備用。以上兩步所制酶液用0.45nm濾紙過濾去除雜蛋白和脂肪等雜質(zhì)，整個過程全部在低溫條件下進(jìn)行。特別注意勻漿時要根據(jù)海藻糖酶的含量加入一定體積的緩沖液。

1.2.3 海藻糖酶活性的測定

海藻糖酶活性的測定參考Dahlqvist的葡萄糖氧化酶終點法［14］，通過生成葡萄糖的量來進(jìn)行測定，并加以改進(jìn)。反應(yīng)介質(zhì)為pH6.0的25mmol／L磷酸氫二鈉－檸檬酸緩沖液，其中含有7mmol／L的海藻糖以及60μmol／L的MnCl2。反應(yīng)在30℃下水浴加熱20min，反應(yīng)完成后立即放入沸水浴中熱變性處理5min。然后立即放入冰里防止蛋白質(zhì)的重新折疊。反應(yīng)產(chǎn)物100μL轉(zhuǎn)入500μL離心管中，4℃，8700×g離心15min，取上清液2μL，加入200μL葡萄氧化酶測定試劑，37℃水浴加熱10min。用紫外分光光度計，在542nm下測定樣品的A值，吸光值的大小反映葡萄糖的含量，根據(jù)葡萄糖試劑盒中葡萄糖的含量5.55μmol／mL，來計算樣品中葡萄糖的含量。海藻糖酶的活力以國際單位U為單位，即在最適條件下，每分鐘將1μmol底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需要的酶量為1U，單位為mU／mg。計算公式為：酶的活 力 U ＝A×5.55mmol／mL×V（酶＋底物）／T（min）；蛋白含量＝C蛋白×稀釋倍數(shù)×酶液體積；酶的比活力＝U／蛋白含量。

1.2.4 蛋白質(zhì)含量的測定

參照Bradford［15］考馬斯亮藍(lán)G250法，用牛血清白蛋白（BSA）制作蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線并測定樣品A值，根據(jù)蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中蛋白的含量。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

對于加入不同發(fā)育階段、不同組織中各種昆蟲間可溶性海藻糖酶活性的差異，進(jìn)行顯著性檢驗，對方差分析顯著的數(shù)據(jù)進(jìn)一步采用LSD進(jìn)行多重比較，檢驗不同酶活性間的差異。所有數(shù)據(jù)均用SPSS 12.0分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 昆蟲不同發(fā)育階段海藻糖酶活性比較

圖1為5種昆蟲在不同發(fā)育階段海藻糖酶活性比較，除玉米螟卵中海藻糖酶活性接近于2齡幼蟲中的活性以外，棉鈴蟲、甜菜夜蛾以及黏蟲3種蟲卵的活性是本試驗各個測定階段活性最低的，其中小菜蛾因為采用蘿卜苗方法飼養(yǎng)，卵塊難以收集，因此活性未測定。玉米螟、甜菜夜蛾和黏蟲幼蟲從低齡到高齡呈現(xiàn)海藻糖酶活性增加的趨勢，其中玉米螟卵、1齡幼蟲、2齡幼蟲的活性分別為29.25、19.76、25.35mU／mg無顯著差異，隨后活性出現(xiàn)驟增，在3齡、4齡幼蟲階段活性分別為79.64、124.07mU／mg，顯著高于前階段（P＜0.05）；甜菜夜蛾1～3齡活性相差不大，均為50mU／mg左右，在4齡海藻糖酶活性驟增，活性為158.43mU／mg，顯著高于前階段（P＜0.05）；黏蟲活性最高為3齡幼蟲，達(dá)到54.49mU／mg。棉鈴蟲和小菜蛾各齡期海藻糖酶活性變化規(guī)律不明顯，棉鈴蟲1～4齡活性分別為26.34、32.20、14.2和40.87mU／mg，小菜蛾1～4齡幼蟲活性分別為50.72、53.48、40.56和55.76mU／mg。另外，本試驗測定的5種昆蟲，蛹期海藻糖酶的活性均低于4齡幼蟲。

圖1 五種昆蟲不同發(fā)育階段海藻糖酶活性比較Fig.1 The activities of soluble trehalase in five insects in different developmental stages

2.2 昆蟲5齡幼蟲不同組織部位海藻糖酶活性比較

圖2為玉米螟、黏蟲、棉鈴蟲和甜菜夜蛾4種昆蟲馬氏管、脂肪體、體壁、血淋巴和中腸等組織部位海藻糖酶的活性，小菜蛾其成蟲由于個體過小，沒有進(jìn)行解剖。數(shù)據(jù)表明，玉米螟5齡幼蟲中腸、體壁、馬氏管、脂肪體和血淋巴分別為316.17、121.25、20.78、13.86和58.86mU／mg，中腸中海藻糖酶活性顯著高于其他組織（P＜0.05）；與玉米螟相似，棉鈴蟲中腸酶活性最高，為39.35mU／mg，顯著高于體壁（6.01mUmg 馬氏管（19.69mUmg 脂肪體（4.33mU／mg）和血淋巴（2.94mU／mg）；甜菜夜蛾5齡幼蟲中腸、體壁、馬氏管、脂肪體和血淋巴中海藻糖酶活性分別為107.27、139.99、109.05、13.74和0.85mU／mg，中腸、體壁和馬氏管中活性最高；黏蟲分別為1.33、4.36、4.69、11.19和0.11mU／mg。但黏蟲的脂肪體中海藻糖酶活性最高。不同昆蟲間海藻糖酶的活性差異較大，玉米螟和甜菜夜蛾各組織的海藻糖酶活性較高，而黏蟲總體酶活性較低。

圖2 四種昆蟲不同組織部位海藻糖酶活性比較Fig.2 The activities of soluble trehalase in four insects in different tissues

3 討論

在昆蟲體內(nèi)，海藻糖酶將海藻糖水解為葡萄糖，而葡萄糖最終被氧化分解，海藻糖酶活性的改變與昆蟲生理學(xué)條件和變化時期密切相關(guān)［2］。家蠶中腸中的海藻糖酶活性在吐絲時開始升高，在幼蟲化蛹蛻皮時突然增長，并在3d后達(dá)到很高水平，這樣的高水平一直保持到隨后的成蟲發(fā)育階段［16］。本研究所選用的5種農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的重要害蟲均為實驗室飼養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)試蟲，其中黏蟲和小菜蛾幼蟲的食物為植物，其他3種昆蟲的飼料為人工飼料。研究結(jié)果表明，除小菜蛾卵沒有測定外，其他4種昆蟲卵的活性最低，其次為蛹，進(jìn)入取食階段后部分幼蟲隨著齡期的增加，其體內(nèi)海藻糖酶的活性有增高的趨勢，這可能是由于其自身對于能量的需求增加，而海藻糖酶作為唯一能水解昆蟲的主要血糖——海藻糖的水解酶類，對于調(diào)節(jié)昆蟲的能量代謝起著至關(guān)重要的作用。進(jìn)入化蛹期后，消化和吸收活性基本停止，取而代之的是排泄活性，因此海藻糖酶的活性比較低。以往研究表明Rhynchosciara americana在饑餓的狀態(tài)其中腸內(nèi)海藻糖酶的活性會降低，隨著取食的增加海藻糖酶的活性也會增加［17］。

昆蟲中幾乎所有的組織內(nèi)都有海藻糖酶［13］。在生活周期的不同階段昆蟲各組織中海藻糖酶有不同的表達(dá)水平，其中許多昆蟲中腸和肌肉中活性較高［18］。在家蠶從幼蟲到蛹和成蟲的發(fā)育過程中，中腸中海藻糖酶的表達(dá)水平最高，其他組織中的表達(dá)水平相對較低［19］。因為幼蟲階段中腸部位是消化和吸收活性最強(qiáng)的部位，所以中腸組織中的海藻糖酶顯示出相對較高的活性也就不足為怪了。在本研究中，小菜蛾因為個體比較小，沒有進(jìn)行解剖。測定玉米螟、黏蟲、棉鈴蟲和甜菜夜蛾5齡幼蟲不同組織部位海藻糖酶的活性研究表明，中腸中海藻糖酶的活性比較高，與文獻(xiàn)研究結(jié)果一致。但不同昆蟲之間中腸海藻糖酶活性差異相當(dāng)大，本研究中玉米螟中腸中海藻糖酶的活性為316mU／mg，而黏蟲中僅為1.336mU／mg，相差高達(dá)200多倍，以往文獻(xiàn)中一種貪夜蛾Spodoptera frugiperda中腸海藻糖酶的活性是家蠅（Musca domestica）的約900倍［13］，這可能是由于昆蟲之間食物的差異以及自身代謝的差異引起的，因此，在以后的研究中可以根據(jù)自身需要選擇海藻糖酶含量豐富的昆蟲及組織部位。

隨著人們對于昆蟲中海藻糖和海藻糖酶生理功能的進(jìn)一步認(rèn)識，認(rèn)識到海藻糖酶對于昆蟲的代謝起著至關(guān)重要的作用，因此可以海藻糖酶作為害蟲防治的重要靶標(biāo)。昆蟲中海藻糖酶的研究將越來越受到人們的重視，本文通過測定我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上重要的5種害蟲海藻糖酶的活性以期對我國開展海藻糖酶方面的研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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