楊善巖，李海龍，王升貴，狄志鴻，張 紅，黃 哲，張 杰

(1.浙江亞林生物科技股份有限公司，浙江 富陽(yáng) 311400;2.嘉吉亞太食品系統(tǒng)有限公司 上海分公司，上海 徐匯 200031;3.諾維信中國(guó)投資有限公司，上海 浦東 200129;4.天津生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，天津 300462)

天然黑色素 (melanin)是廣泛存在于動(dòng)植物體中的保護(hù)性色素，對(duì)生物機(jī)體有重要的保護(hù)作用。Nicollaus［1］根據(jù)黑色素降解產(chǎn)物不同將其分為吲哚型黑色素 (動(dòng)物黑色素)和兒茶酚型黑色素(植物黑色素)。兒茶酚與單寧酸、鞣花酸等一起被稱為植物體內(nèi)的紫外線過(guò)濾器，具有很好的美容防曬效果［2］。黑色素屬于生物大分子多聚物，分子量1 800～2 000 u，其結(jié)構(gòu)單位為酚醌結(jié)構(gòu)，不溶于酸性溶液，微溶于水，不溶于常見(jiàn)的有機(jī)溶劑，僅溶于少數(shù)幾種有毒的有機(jī)溶劑，如甲醇、二甲基亞砜等，但能溶于堿性水溶液。黑色素在紫外波長(zhǎng)下有吸收峰，其吸收值與波長(zhǎng)成反比［3］。黑芝麻黑色素安全無(wú)毒，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥理作用，廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)，如飲料、糕點(diǎn)、糖果、巧克力、果醬等［4］，有著十分廣闊的市場(chǎng)前景。

作者對(duì)文獻(xiàn)報(bào)道的各種黑芝麻黑色素萃取工藝［5－7］進(jìn)行了分析論證，結(jié)合黑色素的理化性質(zhì)進(jìn)行反復(fù)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)采用堿提酸沉淀法簡(jiǎn)單可靠，可得到較純的黑色素，并對(duì)萃取條件進(jìn)行了響應(yīng)面優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料

市售黑芝麻，定量濾紙，NaOH、HCl均為分析純。

1.2 萃取工藝

利用NaOH溶液在一定溫度下水浴萃取，過(guò)濾后用HCl溶液中和濾液pH值至6.0，使黑色素絮凝。3 000 r·min－1離心10 min棄上清液，用水洗滌2～3次，于60℃烘干至恒重，即為黑色素粗品，得率計(jì)算公式如下:

式中:為得率 (%);m為黑色素質(zhì)量 (g);W為黑芝麻質(zhì)量 (g)。

1.3 色階的計(jì)算

精確稱取0.1 g自制黑色素，用pH值為8的磷酸氫二鈉－檸檬酸緩沖液溶解，定容至100 mL作為試樣。吸取10 mL移入100 mL容量瓶，用緩沖液定容至100 mL為待測(cè)樣，測(cè)其A270，色階計(jì)算公式如下［8］:

E=A×n/W。

式中:E為色階;A為吸光值;n為待測(cè)樣品稀釋倍數(shù);W為樣品質(zhì)量 (g)。

2 結(jié)果與討論

2.1 萃取劑濃度對(duì)萃取效果的影響

分別稱取10 g黑芝麻于250 mL三角瓶中，各加入30，35，40，45，50，55，60 g·L－1的 NaOH溶液50 mL，60℃水浴浸提60 min，制備黑色素。如圖1所示，前期黑色素得率及色階都與萃取劑濃度成正比，均在50 g·L－1時(shí)達(dá)到峰值，此后又下降。究其原因，NaOH濃度增加黑色素溶解度增大，然而隨濃度的增加一些雜質(zhì)的溶解率也在增加，與黑色素呈現(xiàn)競(jìng)爭(zhēng)浸出，影響黑色素得率及純度。

圖1 萃取劑濃度對(duì)萃取效果的影響

黑色素存在于黑芝麻種皮中，種皮主要成分為黑色素和木質(zhì)素，木質(zhì)素易溶于NaOH溶液，更加速黑色素的溶解。NaOH溶液濃度不僅影響黑色素萃取效果，而且對(duì)成本及純化也有較大影響，所以萃取劑濃度至關(guān)重要。

2.2 萃取混合物濃度對(duì)萃取效果的影響

分別稱取10 g黑芝麻于250 mL三角瓶，加入NaOH溶液，使萃取混合物濃度分別為200，220，240，260，280，300 g·L－1，60℃ 水浴浸提 60 min，制備黑色素。如圖2所示，黑色素得率與萃取混合物濃度成反比，低于240 g·L－1得率及色階較高且穩(wěn)定;高于240 g·L－1黑色素得率及色階急劇下降。

圖2 萃取混合物濃度對(duì)萃取效果的影響

固液洗脫中，溶液比例越大越利于洗脫。因?yàn)槿芤毫吭酱?，固相與液相之間的目標(biāo)物質(zhì)濃度差就越大，目標(biāo)物質(zhì)就越易溶解到液相。在黑芝麻萃取中，萃取液比例越大黑色素就越易溶出。

2.3 溫度對(duì)萃取效果的影響

分別稱取10 g黑芝麻于250 mL三角瓶中，各加40 mL 50 g·L－1的NaOH溶液。分別于50，55，60，65，70，75，80，85，90℃水浴浸提 60 min，制備黑色素。如圖3所示，黑色素得率與溫度成正比，65℃后增加趨勢(shì)變緩;色階則呈現(xiàn)先高后低的趨勢(shì)，65℃出現(xiàn)峰值。

圖3 萃取溫度對(duì)萃取效果的影響

水分子是不斷運(yùn)動(dòng)的，溫度越高水分子運(yùn)動(dòng)速率越快，溶質(zhì)在溶液中的擴(kuò)散速度就越快，所以黑色素溶解速率越快，但此時(shí)雜質(zhì)也更易溶出而且黑色素的分解也在加速，使黑色素純度降低。

2.4 時(shí)間對(duì)萃取效果的影響

分別稱取10 g黑芝麻于250 mL三角瓶中，各加入50 g·L－1的NaOH溶液40 mL，分別于60℃水浴浸提 20，40，60，80，100，120，140 min，制備黑色素。如圖4所示，黑色素得率隨時(shí)間增長(zhǎng)而提高，80 min后基本不再增加。色階開(kāi)始時(shí)與時(shí)間成正比，80～120 min最大，此后略有下降。

圖4 時(shí)間對(duì)萃取效果的影響

黑色素溶出是一個(gè)漸進(jìn)過(guò)程，時(shí)間越長(zhǎng)得率越高，但時(shí)間越長(zhǎng)雜質(zhì)溶出也越多，影響純度，所以萃取時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)。

2.5 萃取條件的響應(yīng)面優(yōu)化

用 Design-Expert8.0.6的 Box-Behnken試驗(yàn)，對(duì)黑色素萃取條件進(jìn)行四因素三水平試驗(yàn)。因素、編碼、－1，0，1水平:萃取劑濃度 (X1)分別為45，50，55 g·L－1;萃取混合物濃度 (X2)分別為260，240，220 g·L－1;萃取溫度 (X3)分別為60，65，70℃;萃取時(shí)間 (X4)分別為 60，80，100 min。

試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)各處理組合的得率和色階

利用Design-Expert8.0.6軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，擬合得到黑色素得率及色階的多元回歸模型:

對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析，萃取劑濃度、萃取混合物濃度、溫度和時(shí)間對(duì)得率及色階有顯著正效應(yīng)，失擬項(xiàng)P值分別為0.139 6和0.055 0，均 ＞0.05，P為不顯著，說(shuō)明回歸模型顯著。決定系數(shù)R2分別為0.907 4和0.999 3，均 ＞0.9，說(shuō)明回歸模型擬合良好。

D為進(jìn)一步研究相關(guān)變量之間的交互作用及確定最優(yōu)點(diǎn)［9－10］，利用 Design-Expert軟件分析二次回歸模型，繪制響應(yīng)面分析立體圖和等高線圖。圖5－6為部分響應(yīng)面分析立體圖和等高線圖，等高線圖可以直觀地反映兩變量交互作用的顯著程度，各圖中等高線均呈橢圓形，表明兩因素交互作用顯著，由立體圖可見(jiàn)擬合面具有真實(shí)的最大值。經(jīng)軟件分析得到最佳萃取劑濃度、萃取混合物濃度、萃取溫度及萃取時(shí)間分別為 50 g·L－1，240 g·L－1，65℃和80 min。得率和色階的最高預(yù)測(cè)值分別為0.457 7%和245.223。

圖5 萃取混合物濃度和溫度對(duì)得率影響的響應(yīng)面及等高線

2.6 驗(yàn)證試驗(yàn)

為驗(yàn)證模型預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，用優(yōu)化后的條件進(jìn)行試驗(yàn)，黑色素得率為0.439%，E=243.197，基本吻合模型預(yù)測(cè)最大響應(yīng)值，說(shuō)明模型合理有效。

圖6 萃取劑濃度和萃取混合物濃度對(duì)色階影響的響應(yīng)面及等高線

3 小結(jié)與討論

黑芝麻黑色素是一種營(yíng)養(yǎng)及食用價(jià)值均很高的天然功能性色素，我國(guó)對(duì)黑芝麻黑色素的研究開(kāi)發(fā)較少。本研究采用響應(yīng)面法，對(duì)黑芝麻黑色素的堿提酸沉淀萃取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳萃取劑濃度、萃取混合物濃度、萃取溫度及萃取時(shí)間分別為50 g·L－1，240 g·L－1，65 ℃ 和 80 min。經(jīng)驗(yàn)證得率和色階分別為0.439%和243.197。

該工藝制備的黑色素粗品，得率較高，E＞240，純度略低于樣品 (E=310)，所以后期還需要一定的純化工作。需要注意的是，在黑色素分子中存在氨基，中和濾液堿性時(shí)HCl溶液濃度不能太高，否則會(huì)因 HCl局部濃度過(guò)高，與氨基反應(yīng)放出NH3。另外，萃取次數(shù)對(duì)黑色素得率也有一定的影響，在實(shí)際生產(chǎn)中可多次萃取，以提高黑色素得率。該工藝簡(jiǎn)單、成本低廉，而且可變廢為寶提高黑芝麻的附加值。

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