袁 偉，萬紅建，劉云飛，俞 錁，楊悅儉

(1．浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蔬菜研究所，浙江 杭州 310021;2．南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，江蘇 南京 210095)

基因表達(dá)是遺傳信息表現(xiàn)為生物性狀的過程，是按時(shí)間和空間順序進(jìn)行的，這種表達(dá)的方式稱為基因的差異表達(dá)［1］。研究基因差異表達(dá)的方法很多，如抑制消減雜交，電子克隆技術(shù)，基因芯片和cDNA-AFLP技術(shù)等［2］。其中 cDNA-AFLP技術(shù)由于其重復(fù)性高，假陽性低，操作方便快捷，可反映基因間表達(dá)量的差異等優(yōu)勢被廣泛應(yīng)用在植物生物脅迫和非生物脅迫等多個(gè)領(lǐng)域。目前許多研究者將該技術(shù)用于基因的差異表達(dá)分析，尤其在抗病相關(guān)基因方面取得了較好的研究成果［3－5］。

番茄 (Solanum lycopersicumMill．)屬于茄科番茄屬，是世界性的蔬菜作物之一。近年來，隨著番茄栽培面積的增加，番茄黃化曲葉病毒病(TYLCD)已經(jīng)成為番茄生產(chǎn)中最嚴(yán)重的病害之一。據(jù)初步統(tǒng)計(jì)，至少有40個(gè)國家的番茄正遭受此類病害的毀滅［6］。該病害首先在中國南方大面積爆發(fā)，自南向北發(fā)展，給我國的番茄產(chǎn)業(yè)帶來了毀滅性的災(zāi)害［7－11］。該病害由番茄黃化曲葉病毒(TYLCV)引起，一旦發(fā)病，會(huì)造成番茄大幅度減產(chǎn)甚至絕收［12］。

目前，越來越多抗TYLCV的野生番茄被篩選出來，通過野生番茄與栽培番茄雜交可以將抗病基因轉(zhuǎn)入到栽培番茄，從而緩解病害的發(fā)展。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的快速發(fā)展，研究者已經(jīng)鑒定了5種不同抗 TYLCV的基因，分別為Ty-1，Ty-2，Ty-3，Ty-4和Ty-5［13－17］，其中Ty-2抗病基因被廣泛應(yīng)用于育種實(shí)踐之中。為了揭示番茄抗TYLCV的機(jī)理，本文初步分析cDNA-AFLP技術(shù)在番茄 (含有Ty-2抗病基因)與TYLCV互作過程中的應(yīng)用，篩選差異表達(dá)片段，為今后克隆與Ty-2基因相關(guān)基因奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

Banerjee等［18］從多毛番茄 B1063中選育得到抗TYLCV的材料-H24(含有Ty-2抗病基因)，本文使用經(jīng)H24轉(zhuǎn)育后獲得的抗病材料07-027進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，番茄植株生長于人工控制的氣候室內(nèi)(白天25℃，夜間18℃)。

1.2 TYLCV的接種

當(dāng)番茄材料長到4片真葉時(shí)，進(jìn)行TYLCV的接種，將帶有TYLCV的農(nóng)桿菌搖至D值為0.6～1.0，接種部位為番茄莖段的韌皮部，接種量保持一致，每株300 μL菌液。

1.3 總RNA的提取及雙鏈cDNA的合成

分別于接種后0，7，14，21，28，35 d取樣，采用混合取樣法摘取番茄幼嫩葉片，用錫箔紙包好于液氮中保存并放于－80℃超低溫冰箱冷凍保存。

RNA的提取及cDNA的獲得。RNA的提取采用Trizol法，cDNA的合成采用TaKaRa公司cDNA Synthesis kit合成雙鏈cDNA試劑盒，隨后調(diào)整6個(gè)樣品的cDNA濃度，使其一致。

1.4 cDNA-AFLP技術(shù)

cDNA-AFLP體系及程序參照 Vos等［19］的方法。分別用EcoRI，MseI酶切雙鏈 cDNA，37℃下4～6 h后與相應(yīng)接頭連接，16℃過夜;連接后產(chǎn)物用預(yù)擴(kuò)增引物擴(kuò)增，將稀釋20倍的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物作為模板進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，以篩選抗黃化曲葉病毒病相關(guān)基因差異表達(dá)片段。接頭、預(yù)擴(kuò)增及選擇性擴(kuò)增的引物見表1，其中選擇性擴(kuò)增引物互相配對共64對。使用Bio-labs公司的SEQENCE-GT型電泳儀和測序電泳裝置，采用6%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳 (PAGE)分析。

為減少假陽性對試驗(yàn)結(jié)果的干擾，本試驗(yàn)對每個(gè)引物組合均作2次PCR擴(kuò)增，只統(tǒng)計(jì)在2次擴(kuò)增中都能穩(wěn)定出現(xiàn)的條帶。

表1 接頭，預(yù)擴(kuò)增及選擇性擴(kuò)增引物

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA和cDNA質(zhì)量檢測

本試驗(yàn)使用 Trizol法提取的幼葉總RNA具有較高的純度和濃度。1.2%瓊脂糖電泳檢測時(shí)可以看到亮而清晰的28S，18S和5S三條帶 (圖1)，且28S帶亮度略強(qiáng)于18S帶。經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測，D260/D280值為 1.8～2.0，D260/D230值 ＞2.0，表明RNA純度較好，基本無降解，蛋白質(zhì)和酚類的污染少，效果比較理想，可以用于下一步實(shí)驗(yàn)。

圖1 RNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果

RNA經(jīng)純化后，使用cDNA合成試劑盒合成雙鏈cDNA，通過擴(kuò)增其內(nèi)參基因來進(jìn)行檢測。本文選用的內(nèi)參基因?yàn)镚APDH(gi:380036164)，上游引物 F:GGCTGCAATCAAGGAGGAA，下游引物R:AAATCAATCACACGGGAACTG，目的片段大小為220 bp左右，通過PCR擴(kuò)增后，用1.2%的瓊脂糖電泳進(jìn)行檢測 (圖2)，檢測結(jié)果表明，條帶單一且清晰，雙鏈cDNA具有較好的質(zhì)量及較高的濃度。

圖2 cDNA的GAPDH擴(kuò)增結(jié)果

2.2 酶切、連接和預(yù)擴(kuò)產(chǎn)物的檢測

選擇有6個(gè)堿基識(shí)別位點(diǎn)限制性內(nèi)切酶EcoRI和MseI，對合成的雙鏈cDNA進(jìn)行酶切，經(jīng)1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測 (圖3)，均看到 100～2 000 bp的彌散條帶，表明酶切充分，其中100～750 bp條帶很亮，表明片段大多分布在這一區(qū)域內(nèi)。

圖3 酶切產(chǎn)物的瓊脂糖電泳檢測結(jié)果

酶切產(chǎn)物經(jīng)連接之后，使用預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行與擴(kuò)增，對于預(yù)擴(kuò)增的產(chǎn)物用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測 (圖 4)。結(jié)果表明，條帶100～1 500 bp，條帶彌散穩(wěn)定，產(chǎn)物清晰，可用于下一步的選擇性擴(kuò)增。

2.3 cDNA-AFLP的差異表達(dá)分析

圖4 預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖電泳檢測結(jié)果

基因的表達(dá)差異在cDNA-AFLP的轉(zhuǎn)錄譜上主要表現(xiàn)為2個(gè)方面:量的差異 (條帶的深或淺)和質(zhì)的差異 (條帶有或無)。本研究共選用64對引物進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，分析抗TYLCV的番茄材料在不同時(shí)段中基因的差異表達(dá)。結(jié)果表明，共擴(kuò)增出2 149條轉(zhuǎn)錄片段，其中差異條帶287條，上調(diào)156條，下調(diào)131條。圖5為部分cDNA-AFLP的轉(zhuǎn)錄圖譜，引物對分別為E-ACG/M-CTG， E-ACG/M-CCT， E-AGG/M-CAT，E-ACG/M-ACT。

從量的差異方面來看，圖5中A，B對應(yīng)的圖表示有量的變化，箭頭所指的部分表明該轉(zhuǎn)錄片段隨著時(shí)間的變化，表達(dá)量亦發(fā)生了改變，A中箭頭所指的轉(zhuǎn)錄片段在接種后的14，21，28 d表達(dá)量升高，整體呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢;從質(zhì)的差異方面來看，圖5中 C，D對應(yīng)的圖表示有質(zhì)的變化，箭頭所指的部分表明該轉(zhuǎn)錄片段隨著時(shí)間的變化，間歇性地表達(dá)，C中箭頭所指的轉(zhuǎn)錄片段在接種后的7，21，35 d沒有表達(dá)。

圖5 部分選擇性擴(kuò)增引物在6個(gè)不同時(shí)段的擴(kuò)增譜帶

3 小結(jié)和討論

試驗(yàn)中 RNA的提取采用Trizol法。在提取過程中，首先要防止RNA的降解，因?yàn)樵谥車目諝饧耙磺袑?shí)驗(yàn)器材上都避免不了RNA酶的存在;其次要減少DNA、蛋白質(zhì)及酚類物質(zhì)的污染，提高RNA的純度。從結(jié)果看，試驗(yàn)中提取的RNA質(zhì)量及純度均較高，適合用于下一步的研究。檢測合成的雙鏈 cDNA，采用番茄最常用的內(nèi)參基因GAPDH。從電泳圖中可以看出條帶大小，亮度均十分一致，表明雙鏈cDNA的濃度一致，減少了檢測樣本之間的差異。酶切和預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測可以清晰的看到彌散均勻的條帶，表明雙酶切可以使酶切更充分，而預(yù)擴(kuò)增可以使與預(yù)擴(kuò)增引物配對的片段都預(yù)先擴(kuò)增出來，防止其它過多的條帶影響選擇性擴(kuò)增的結(jié)果，并為下一步的選擇性擴(kuò)增提供了高質(zhì)量的模板。

通過選擇性擴(kuò)增共獲得287個(gè)轉(zhuǎn)錄差異片段，表明存在很多的與抗TYLCV相關(guān)的候選基因可能與抗病防御機(jī)制的功能蛋白相關(guān)。轉(zhuǎn)錄片段的差異表現(xiàn)從兩個(gè)不同的方面體現(xiàn):首先是表達(dá)量的差異。某些基因的轉(zhuǎn)錄水平在各時(shí)間段表現(xiàn)出表達(dá)量的增強(qiáng)或減少。其次是質(zhì)的差異。基因的表達(dá)在某一時(shí)間段甚至不表達(dá)，而在另一時(shí)間段又恢復(fù)表達(dá)。由于cDNA-AFLP技術(shù)顯示的是在植物轉(zhuǎn)錄水平上的差異，因此從分析結(jié)果看，表明基因的表達(dá)受到時(shí)間和空間的多重影響，番茄與TYLCV之間的互作機(jī)制和抗病反應(yīng)也是植物體一系列功能基因轉(zhuǎn)錄水平上發(fā)生變化的綜合反應(yīng)。

本研究表明，cDNA-AFLP技術(shù)對于揭示番茄與TYLCV互作機(jī)理是一種有效的方法，同時(shí)獲得的差異片段也可用于番茄抗TYLCV相關(guān)基因的克隆，為未來鑒定這些基因的功能奠定基礎(chǔ)。

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