王光明 吳雪梅 王睿君 楊福偉 趙洪衛(wèi) 付雙林 (吉林大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)外科，吉林 長春 3002)

雖然膠質(zhì)瘤的發(fā)病率較低，但它存在著較高的病死率。目前常規(guī)的治療手段仍然是手術(shù)及術(shù)后輔以放、化療，但并不能完全去除或殺死顱內(nèi)的腫瘤細(xì)胞。因此，找到一種合理有效的治療藥物成為神經(jīng)外科醫(yī)生急需解決的問題〔1〕。布魯生是中藥馬錢子有效成分之一，具有鎮(zhèn)痛、免疫抑制、抗炎和抑制血小板聚集等多種藥理活性。近年來人們研究發(fā)現(xiàn)，布魯生具有明顯抑制胃癌、肺癌、前列腺癌生長的作用，并誘導(dǎo)其凋亡〔2，3〕。本實(shí)驗(yàn)探討布魯生的抗膠質(zhì)瘤作用機(jī)制及環(huán)氧合酶(COX)-2表達(dá)的關(guān)系，為布魯生的臨床應(yīng)用提供必要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑 布魯生購自美國Bellancom公司。DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清購自美國Invitrogen公司。MTT為美國Sigma公司產(chǎn)品。吖啶橙(AO)/溴乙啶(EB)均購于碧云天公司。PI、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒為美國Sigma公司產(chǎn)品。抗BCL-2、BAX、COX-2鼠單抗IgG、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗兔、抗鼠二抗均購自碧云天生物研究所。ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒購自美國Pierce公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人膠質(zhì)瘤SHG-44細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞研究所，予含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，在5%CO2飽和濕度的37℃孵箱中培養(yǎng)，細(xì)胞長滿后經(jīng)胰酶消化法傳代。

1.2.2 MTT法測細(xì)胞成長抑制率 取對數(shù)生長期的SHG-44細(xì)胞，消化、計(jì)數(shù)，調(diào)整密度為6×104/ml，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μl。每組分別設(shè)6個(gè)復(fù)孔，細(xì)胞貼壁生長18 h后，更換DMEM培養(yǎng)液。分別培養(yǎng)12、24、48 h，實(shí)驗(yàn)組加入含不同濃度布魯生的培養(yǎng)液，終濃度為0.125、0.25、0.5、1.0、1.5 mmol/L，對照組加入等量DMEM培養(yǎng)液。分別培養(yǎng)12、24、48 h。每孔加入 MTT溶液(5 mg/ml)20 μl。4 h后吸取孔內(nèi)的培養(yǎng)液。加入DMSO后，振蕩10 min使其內(nèi)甲瓚充分溶解。在酶標(biāo)儀上檢測各孔的吸光度(490 nm激發(fā)波長)值，重復(fù)檢測3次，取平均值。與對照組比較，計(jì)算各組細(xì)胞生長抑制率。生長抑制率(%)=(1－實(shí)驗(yàn)組 OD值/對照組 OD值)×100%。

1.2.3 吖啶橙(AO)/溴乙啶(EB)染色觀察 取對數(shù)生長期的SHG-44細(xì)胞，消化、計(jì)數(shù)，調(diào)整密度為6×104/ml接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μl。每組分別設(shè)6個(gè)復(fù)孔，細(xì)胞貼壁生長18 h后，更換DMEM培養(yǎng)液。分別培養(yǎng)24 h，實(shí)驗(yàn)組加入含不同濃度布魯生的培養(yǎng)液，終濃度為0.25、0.5、1.0 mmol/L，對照組加入等量DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。吸凈DMEM培養(yǎng)液，50 μl PBS液洗一遍，再加入50 μl PBS液后，加入預(yù)配好的AO、EB(10 mg/ml)各1 μl，避光2 min 后，熒光顯微鏡下以藍(lán)色激發(fā)光觀察細(xì)胞形態(tài)及顏色并照相。

1.2.4 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期變化 取對數(shù)生長期SHG-44細(xì)胞，消化、計(jì)數(shù)，調(diào)整密度為2×105/ml，培養(yǎng)瓶每瓶接種細(xì)胞1 ml，37℃培養(yǎng)18 h后更換實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)組加入含0.25、0.5、1.0 mmol/L布魯生的培養(yǎng)液，對照組加入等量DMEM培養(yǎng)液，作用24 h后分別終止培養(yǎng)。用胰酶消化細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌2遍，加入FITC標(biāo)記的Annexin V(2 μl)，冰上溫育20 min，迅速加入PI(1 μg/ml)，于流式細(xì)胞儀 FACS Calibur(Becton Dickson，USA)上檢測細(xì)胞凋亡情況，Annexin V陰性/PI陰性為正常細(xì)胞;Annexin V陽性/PI陰性為早期凋亡細(xì)胞;Annexin V陽性/PI陽性為晚期凋亡細(xì)胞。

1.2.5 Western蛋白印跡法檢測細(xì)胞中BCL-2、BAX、COX-2的表達(dá)情況 取對數(shù)生長期SHG-44細(xì)胞，消化、計(jì)數(shù)，調(diào)整密度為106/ml，培養(yǎng)瓶每瓶接種細(xì)胞1 ml，37℃培養(yǎng)18 h后更換培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)組加入含0.25、0.5、1.0 μmol/L布魯生的培養(yǎng)液，對照組加入等量DMEM培養(yǎng)液，作用24 h后分別終止培養(yǎng)。用細(xì)胞刮刀刮取貼壁細(xì)胞，連同培養(yǎng)液一同離心收集細(xì)胞。蛋白抽提方法和Western蛋白印跡法參照碧云天公司說明書。使用BCA法測定蛋白濃度，β-actin作為參照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件，多組比較進(jìn)行單因素方差分析，兩兩比較進(jìn)行Student t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測細(xì)胞存活率 不同劑量(0.125、0.25、0.5、1.0、1.5 mmol/L)布魯生分別處理 SHG-44 細(xì)胞12、24、48 h 后，細(xì)胞存活率呈現(xiàn)時(shí)間依賴性和劑量依賴性地降低。0.5 mmol/L的布魯生對SHG-44細(xì)胞作用24 h的存活抑制率達(dá)到66.8%，說明SHG44細(xì)胞的生長能被布魯生有效的抑制。見圖1。

圖1 MTT顯示不同濃度/時(shí)間的布魯生對SHG-44細(xì)胞生長和增殖的影響

圖2 AO/EB染色顯示不同濃度的布魯生作用SHG-44細(xì)胞24 h

2.2 AO/EB染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 實(shí)驗(yàn)組與對照組經(jīng)AO/EB染色后均在電子熒光顯微鏡下經(jīng)BV濾片激發(fā)，可觀察到對照組核染色質(zhì)著綠色熒光并呈正常結(jié)構(gòu);實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)凋亡細(xì)胞，早期凋亡細(xì)胞(VA)核染色質(zhì)著綠色呈固縮狀或圓珠狀;非凋亡的死亡細(xì)胞(NVN)核染色質(zhì)著橘紅色并呈正常結(jié)構(gòu);晚期凋亡細(xì)胞(NVA)核染色質(zhì)為橘紅色并呈固縮狀或圓珠狀?？梢园l(fā)現(xiàn)布魯生呈劑量性的誘導(dǎo)SHG-44細(xì)胞的凋亡，見圖2。為進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)果，再采用流式細(xì)胞儀，Annexin V/PI雙染法檢測布魯生對A549細(xì)胞膜PS外翻情況及細(xì)胞膜完整情況，結(jié)果顯示經(jīng)不同濃度布魯生處理24 h后，SHG44細(xì)胞晚期凋亡呈現(xiàn)劑量依賴性地增強(qiáng)，見圖3。

2.3 布魯生對SHG-44細(xì)胞作用24 h后BCL-2、BAX、COX-2的表達(dá)情況 布魯生能劑量依賴性地降低SHG-44細(xì)胞抗凋亡蛋白BCL-2蛋白的表達(dá)，相應(yīng)的劑量性地升高促凋亡BAX蛋白的表達(dá)。與此同時(shí)，布魯生還呈劑量性地降低SHG44細(xì)胞中COX-2蛋白的表達(dá)(圖4)。

圖3 流式細(xì)胞儀檢測不同濃度的布魯生作用SHG-44細(xì)胞24 h

圖4 Western印跡檢測不同濃度布魯生對SHG-44細(xì)胞的BCL-2、BAX、COX-2表達(dá)的影響

3 討論

布魯生是從中藥馬錢子中提取的吲哚型結(jié)構(gòu)的生物堿，是馬錢子發(fā)揮藥效的主要成分之一。近年來，布魯生的抗腫瘤活性逐漸成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。有研究報(bào)道，布魯生能明顯抑制肝癌、肺癌、前列腺癌等多種腫瘤細(xì)胞的生長〔4，5〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，布魯生在體外對SHG-44細(xì)胞的生長具有顯著的抑制作用，并與藥物濃度及作用時(shí)間明顯相關(guān)，顯示良好的時(shí)間/劑量效應(yīng)關(guān)系，與文獻(xiàn)〔6〕報(bào)道一致。證實(shí)馬錢子堿可誘導(dǎo)SHG44細(xì)胞凋亡，且在一定范圍內(nèi)呈劑量效應(yīng)關(guān)系，隨藥物作用濃度的增加，凋亡率也逐漸上升。為了進(jìn)一步證實(shí)布魯生對膠質(zhì)瘤SHG44細(xì)胞凋亡的影響，本文通過Western印跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)布魯生可以明顯上調(diào)BAX蛋白的表達(dá)、下調(diào)BCL-2蛋白的表達(dá)，同時(shí)布魯生可以劑量性地升高COX-2蛋白的表達(dá)。綜上，本文從不同側(cè)面、不同水平證實(shí)布魯生通過細(xì)胞內(nèi)途徑誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞SHG44誘導(dǎo)凋亡。

COX-2在大多數(shù)正常組織中均不表達(dá)，而在多種腫瘤組織中呈高表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。COX-2主要通過促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)腫瘤血管形成、增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移和抑制免疫功能等機(jī)制導(dǎo)致或促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。有文獻(xiàn)報(bào)道，特異性的COX-2抑制劑等非甾體抗炎藥如塞來昔布、尼美舒利、阿司匹林等具有明顯的抗腫瘤活性〔7〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示布魯生可能通過對COX-2蛋白表達(dá)的抑制而促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡，但對腫瘤的作用可能并不局限于對COX-2表達(dá)的抑制。

本實(shí)驗(yàn)初步研究表明，馬錢子堿有明顯抑制膠質(zhì)瘤SHG44細(xì)胞生長的作用，并且該抑制作用可能是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的。這為今后在臨床上應(yīng)用馬錢子堿治療腫瘤提供了一定的實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。但細(xì)胞凋亡的過程是復(fù)雜多途徑的，馬錢子堿誘導(dǎo)SHG-44細(xì)胞凋亡的可能途徑和相關(guān)基因尚需進(jìn)一步研究。布魯生雖具有明顯的抗腫瘤效果，但同時(shí)應(yīng)該注意其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的用量較大，與實(shí)際布魯生的體內(nèi)用量可能有些偏差。在以后的研究中，以期發(fā)現(xiàn)毒性小、效果顯著的化合物〔8〕。

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