葉保國(guó) 李新白 張文文 朱慶三 宋雪松 (吉林大學(xué)第一醫(yī)院麻醉科，吉林 長(zhǎng)春 3002)

學(xué)習(xí)和記憶的分子基礎(chǔ)是修飾神經(jīng)元突觸產(chǎn)生腦電活動(dòng)，即突觸可塑性。神經(jīng)元通過(guò)幾種形式改變突觸強(qiáng)度，使得長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(LTP)時(shí)特異的突觸活動(dòng)增強(qiáng)，長(zhǎng)時(shí)程抑制(LTD)時(shí)特定的突觸活動(dòng)削弱。Arc是長(zhǎng)期記憶形成所特別需要的，并影響所有這些突觸可塑性的形式。Arc在大腦的谷氨酸能神經(jīng)元表達(dá)以適應(yīng)行為和學(xué)習(xí)增強(qiáng)的突觸活動(dòng)〔1～4〕，其轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成的定位被嚴(yán)格調(diào)控，在樹(shù)突〔5，6〕、突觸后密集區(qū)〔5，7，8〕和核〔9，10〕高度表達(dá)。通過(guò)基因敲除(KO)去除 Arc，雖然不影響短期學(xué)習(xí)，但不能形成長(zhǎng)期記憶〔11〕。記憶無(wú)疑受衰老和疾病的影響，已研究報(bào)道在衰老的海馬Arc基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平下降，但有關(guān)幼年階段Arc與記憶能力的關(guān)系未見(jiàn)研究報(bào)道。本文擬了解不同發(fā)育階段影響記憶能力的基因的表達(dá)水平，以探索疾病導(dǎo)致突觸可塑性功能障礙的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 水迷宮 水迷宮為圓形水槽，直徑130 cm，高50 cm，池

水深32 cm，加入黑色食用色素，測(cè)試過(guò)程中使水溫保持(26±1)℃，測(cè)試過(guò)程室溫保持(20±2)℃。房間光照恒定。在水槽壁上按方位等距離、以不同形狀的剪紙標(biāo)記四個(gè)點(diǎn)S、N、E、W，并依此順序作為放入鼠的位點(diǎn)，在N和W點(diǎn)形成的區(qū)域內(nèi)距離槽壁28 cm處放置一平臺(tái)，直徑11 cm、高30 cm，使其位于水面下2 cm，并用3層白色紗布包裹縛牢，修剪整齊。在水槽正上方安置連接顯示器的攝像頭，同步記錄大鼠的移動(dòng)軌跡。

1.2 主要試劑和動(dòng)物 抗大鼠Arc抗體，Abgent公司;HRP標(biāo)記二抗IgG，DAB顯色試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司。雄性SD大鼠，SPF級(jí)，由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.3 方法

1.3.1 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 取2月齡和6月齡鼠各12只作為實(shí)驗(yàn)組，其余2月齡和6月齡大鼠各12只作為各自的對(duì)照組，進(jìn)行水迷宮訓(xùn)練。將鼠放到平臺(tái)上適應(yīng)10 s取下，將大鼠隨機(jī)從不同象限面壁放入水中，觀察其能否找到平臺(tái)。若在水中轉(zhuǎn)一圈仍找不到，則引導(dǎo)其找到，待鼠登上平臺(tái)后10 s取下，重復(fù)上述過(guò)程一次。訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)結(jié)束4 h后，進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)。取受訓(xùn)過(guò)的鼠從規(guī)定的第一點(diǎn)面壁放入水中，計(jì)時(shí)鼠登上平臺(tái)的時(shí)間，為逃避潛伏期。最長(zhǎng)記錄時(shí)間為90 s，若大鼠在90 s內(nèi)不能登上平臺(tái)，其逃避潛伏期計(jì)為90 s，同時(shí)記錄大鼠在平臺(tái)象限的停留時(shí)間，即進(jìn)入平臺(tái)象限到登上平臺(tái)的時(shí)間。順次從標(biāo)記的4個(gè)點(diǎn)分別完成該過(guò)程，2次的時(shí)間間隔為15～20 min。每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)將鼠放入保溫箱內(nèi)吹干，放回鼠籠。每天如此進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)，共3 d。

1.3.2 免疫組化檢測(cè)大鼠海馬Arc的表達(dá) 斷頭處死大鼠，剝離海馬組織，固定、包埋、切片后，脫蠟、脫水，抗原修復(fù)后，BSA封閉2 h;滴加Arc抗體(1∶500)，37℃孵育過(guò)夜，PBS洗滌3次;滴加HRP標(biāo)記的二抗(1∶1 000)，37℃孵育2h，PBS洗滌3次;DAB顯色。鏡下觀察，照相。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS16.0軟件行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 不同月齡大鼠在平臺(tái)象限停留時(shí)間 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著入水次數(shù)的增加，2月齡和6月齡大鼠在平臺(tái)象限停留時(shí)間逐漸縮短(P＜0.05或P＜0.01)，2月齡大鼠每天每次在平臺(tái)象限停留時(shí)間比6月齡大鼠長(zhǎng);隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加，2月齡大鼠平臺(tái)象限停留時(shí)間明顯縮短(P＜0.01或P＜0.001)，6月齡大鼠停留時(shí)間也縮短，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義至第2天、第3天6月齡大鼠停留時(shí)間已趨于穩(wěn)定，表明6月齡大鼠形成記憶能力較強(qiáng)，較快形成長(zhǎng)期記憶。雖然第3天2月齡大鼠停留時(shí)間接近6月齡大鼠，但其記憶形成能力不穩(wěn)定。每天2月齡大鼠第4次入水停留時(shí)間比第3次有所升高，考慮是受方位及年齡等因素影響。見(jiàn)表1。

表1 2月齡、6月齡大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)平臺(tái)象限停留時(shí)間(，S，n=12)

表1 2月齡、6月齡大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)平臺(tái)象限停留時(shí)間(，S，n=12)

與 S點(diǎn)比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01

時(shí)間點(diǎn) S 2月齡 6月齡N E W月齡第一天 19.71±9.88 9.84±8.14 13.94±9.521) 7.03±5.94 5.55±5.551) 4.91±3.56 7.89±5.042)2月齡 6月齡2月齡 6月齡2月齡 6 4.99±5.66第二天 9.85±5.92 7.37±5.46 6.91±5.50 3.39±2.011) 2.98±1.14 4.07±5.20 3.87±3.692) 3.65±3.27第三天 5.27±4.71 2.89±1.56 3.53±1.72 3.74±3.23 2.90±1.60 3.09±2.74 5.81±3.68 5.35±7.67

2.2 免疫組化分析Arc在大鼠海馬的表達(dá) 進(jìn)行行為訓(xùn)練的大鼠Arc表達(dá)量高于未接受行為訓(xùn)練的對(duì)照組大鼠，且接受行為訓(xùn)練的6月齡大鼠Arc表達(dá)量高于2月齡大鼠。見(jiàn)圖2。

圖2 免疫組化檢測(cè)水迷宮實(shí)驗(yàn)的2月齡和6月齡大鼠海馬Arc的表達(dá)(×100)

3 討論

大腦對(duì)外界信息的存儲(chǔ)和處理是通過(guò)神經(jīng)元突觸相互連接形成的網(wǎng)絡(luò)來(lái)完成的。眾所周知，大腦長(zhǎng)期存儲(chǔ)信息是依賴于快速的、從頭的RNA和蛋白的合成，分子合成是長(zhǎng)期形成突觸可塑性如LTP和LTD必不可少的，突觸可塑性是學(xué)習(xí)和記憶的基礎(chǔ)。立即早期基因Arc(也稱為Arg3.1)是將行為與神經(jīng)元活動(dòng)信息最緊密耦聯(lián)的分子〔12〕。

Arc是高度保守的單拷貝基因，在許多種不同的行為模式均可被誘導(dǎo)，具有重現(xiàn)性。Guzowski等〔12〕應(yīng)用熒光原位雜交方法檢測(cè)出5 min空間探索訓(xùn)練可誘導(dǎo)約40%海馬CA1神經(jīng)元的Arc轉(zhuǎn)錄，證實(shí)了在體內(nèi)Arc可促進(jìn)海馬和皮質(zhì)完成學(xué)習(xí)功能。而這一區(qū)域易受到傷害進(jìn)入衰老狀態(tài)，同正常衰老一樣影響記憶功能。但幼齡階段Arc的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平不清楚。本文結(jié)果表明6月齡大鼠形成記憶能力較強(qiáng)，較快形成長(zhǎng)期記憶。雖然第3天2月齡大鼠停留時(shí)間接近6月齡大鼠，但其記憶形成能力不穩(wěn)定，且易受方位及年齡等因素影響。免疫組化檢測(cè)結(jié)果表明不同月齡大鼠Arc的表達(dá)水平不同，其表達(dá)水平直接影響大鼠的學(xué)習(xí)、記憶形成能力。

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