劉飛飛 楊安幫 溫豐標 劉東雷 楊 洋 吳 愷 趙 松

(鄭州大學第一附屬醫(yī)院胸外科，河南 鄭州 450052)

化療和放療在腫瘤細胞內(nèi)可以誘導細胞發(fā)生自噬〔1〕。順鉑(DDP)是肺癌化療常用的藥物之一，通過干擾DNA復制誘導細胞凋亡，還能促進細胞自噬性死亡，但癌細胞容易對其產(chǎn)生耐藥性，因此，如何提高DDP誘導癌細胞凋亡能力，增加癌細胞對其敏感性是困擾臨床急需解決的問題。相關研究認為自噬是化療藥物作用機制之一，可能在耐藥性中發(fā)揮一定作用〔2〕。本研究通過DDP誘導肺癌A549細胞凋亡，再聯(lián)合自噬抑制劑三甲基腺嘌呤(3－MA)，探討抑制自噬對DDP誘導肺癌A549細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑 肺癌A549細胞由河南省高等學校臨床醫(yī)學重點學科開放實驗室提供;3－MA、Hoechst33342熒光染料、二甲基亞砜(DMSO)、單丹黃酰尸胺(MDC)、四甲基偶氮唑鹽(MTT)購于Sigma公司。DDP購于山東齊魯制藥有限公司。胎牛血清購于杭州四季青生物工程材料有限公司。無血清細胞凍存培養(yǎng)基(RPMI1640)、不含乙二胺四乙酸(EDTA)胰蛋白酶、4%多聚甲醛購于北京索萊寶科技有限公司。Annexin6異氰酸熒光素/碘化丙啶(V－FITC/PI)細胞凋亡檢測試劑盒購于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及分組 用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基在37℃、5%CO2、濕度飽和的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞，每3 d更換一次培養(yǎng)液，用胰酶混合液(含0.02%EDTA和0.25%胰酶)消化細胞進行傳代或實驗操作。實驗分為不加藥物干預的對照組、3－MA組、DDP組、3－MA和DDP聯(lián)合作用組(同時加入DDP和3－MA)。

1.2.2 MTT法檢測藥物最適濃度和作用時間 取對數(shù)生長期細胞進行消化制成細胞懸液，以1×105個/ml濃度接種于96孔板，每孔150 μl，培養(yǎng)24 h，棄培養(yǎng)液，分別加入一系列濃度梯度的DDP及3－MA，每孔加入150 μl，每個濃度設置5個復孔，對照組加入等體積培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2、濕度飽和的培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48、72 h。然后每孔加入濃度為5 g/L的四唑鹽(MTT)20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄培養(yǎng)液，然后每孔加入150 μl DMSO，振動10 min，通過酶標儀測490 nm波長的吸光度值，細胞抑制率=〔1－實驗組A490 nm/對照組A490 nm〕×100%，每次實驗重復3次。

1.2.3 MTT法檢測細胞增殖率 按上述方法于96孔板接種細胞培養(yǎng)24 h，按實驗分組分別加入終濃度為10 mmol/L的3－MA和5 mg/L的DDP，分別設不加細胞的空白對照組、不加藥物的對照組，對照組加入等體積的培養(yǎng)液，每組設5個復孔，置于37℃、5%CO2、濕度飽和的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后每孔加入濃度為5 g/L的MTT 20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄培養(yǎng)液，然后每孔加入150 μl DMSO，振動10 min，通過酶標儀測490 nm波長的吸光度值，細胞增殖率=實驗組A490 nm/對照組A490 nm×100%，每次實驗重復3次。

1.2.4 MDC染色檢測細胞自噬變化〔3〕用胰蛋白酶處理處于對數(shù)生長期的肺癌A549細胞，以1×105個/ml濃度加入24孔板，待細胞貼壁后，根據(jù)實驗分組加入相應濃度藥物作用24 h，棄培養(yǎng)液，用濃度為 50 μmol/L的 MDC在 37℃ 孵育60 min，PBS洗3次，用4%多聚甲醛4℃固定15 min，PBS洗3次，用倒置熒光顯微鏡觀察自噬空泡的變化情況并攝片，通過流式細胞儀測定不同組細胞熒光強度。

1.2.5 Hoechst33342染色檢測細胞形態(tài)變化 用胰蛋白酶消化處于對數(shù)生長期的細胞，制成1×105個/ml細胞懸液，接種于24孔板中，待細胞貼壁后，分別加入相應濃度藥物作用24 h后，棄培養(yǎng)液，PBS沖洗2次，加入Hoechst33342(1 mg/L)避光對細胞染色，37℃孵育20 min，PBS沖洗2次，然后用倒置熒光顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化，并攝片，計算熒光染色陽性細胞百分比。

1.2.6 流式細胞術檢測細胞凋亡率 取對數(shù)生長期細胞，經(jīng)消化制成1×105個/ml細胞懸液，接種于6孔板中，待細胞貼壁后，按實驗分組加入相應濃度藥物作用24 h，用不含EDTA的胰蛋白酶消化收集細胞，PBS沖洗2次，按照 Annexin VFITC/PI試劑盒說明書，室溫避光作用15 min，上流式細胞儀進行檢測，每次實驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學方法 應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析，實驗結果用表示，采用單因素方差分析進行多組間比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 MTT法測定藥物最適濃度和作用時間 不同藥物濃度作用不同時間對細胞生長抑制率影響不同。通過MTT法發(fā)現(xiàn)隨著3－MA和DDP濃度和作用時間增加，細胞生長抑制率增加，當3－MA作用24 h時 IC10為10 mmol/L;當 DDP作用24 h時IC50為5 mg/L。因此，實驗中選擇3－MA和DDP最終濃度分別為10 mmol/L和5 mg/L。

2.2 MA和DDP對肺癌A549細胞增殖的影響 單獨應用3－MA對細胞增殖無明顯影響。單獨應用DDP細胞增殖率明顯下降〔(49.7±2.4)%〕。3－MA和DDP組細胞增殖率〔(29.3±2.8)%〕與單獨應用DDP相比明顯下降(P＜0.05)。

2.3 MDC染色檢測細胞自噬變化 由于MDC處理細胞后多聚集在自噬空泡中，在細胞核周圍可見到藍綠色或黃綠色點狀結構出現(xiàn)。單獨應用3－MA作用于細胞未見明顯自噬空泡出現(xiàn)，流式細胞儀測細胞熒光強度為〔(97.8±7.1)%〕，與對照組熒光強度〔(81.1±9.1)%〕相比無明顯差異。單獨應用DDP細胞染色質(zhì)凝聚，細胞中出現(xiàn)自噬空泡，熒光強度為(213.5±21.3)%，與對照組相比差異顯著(P＜0.05)，說明在DDP作用下細胞發(fā)生自噬。3－MA與DDP聯(lián)合作用組與單獨應用DDP組相比，自噬空泡減少，熒光強度明顯下降為(112.3±13.8)%，組間比較差異顯著(P＜0.05)。見圖1。

圖1 MDC染色檢測肺癌A549細胞自噬空泡的變化(×400)

2.4 Hoechst33342染色檢測細胞形態(tài)變化 單獨應用3－MA，細胞形態(tài)未見明顯變化，Hoechst33342染色陽性細胞百分比為(3.1±0.9)%。單獨應用DDP，細胞核裂解，染色質(zhì)凝聚，表明細胞發(fā)生凋亡，陽性細胞百分比為(8.0±0.5)%。3－MA+DDP組細胞凋亡明顯增加，陽性細胞百分比為(15.2±1.1)%，與單獨應用DDP組相比差異顯著(P＜0.05)。見圖2。

2.5 流式細胞術檢測細胞凋亡率 單獨應用3－MA組細胞凋亡率為(3.2±0.8)%，與對照組`相比未見明顯差異。單獨應用DDP組細胞凋亡率增加為(13.5±1.4)%，與對照組相比差異顯著(P＜0.05)。3－MA+DDP組細胞凋亡率明顯增加，為(23.6±2.1)%，與單獨應用DDP組相比差異顯著(P＜0.05)，表明3－MA在促進細胞凋亡方面發(fā)揮一定作用。

3 討論

肺癌是當今世界上最常見惡性腫瘤之一〔4〕。研究發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展與自噬調(diào)控機制的失調(diào)有關。但有關自噬在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中所起的具體作用目前尚不完全清楚，研究發(fā)現(xiàn)自噬的作用可能與不同腫瘤細胞在不同時間所處的具體環(huán)境有關〔5〕。

DDP是一種可用于多種惡性腫瘤(包括肺癌)的廣譜化療藥物，可以抑制癌細胞的DNA復制過程，并損傷細胞膜結構，但其腫瘤耐藥性一直是臨床治療難以克服的障礙〔6〕。有研究〔7～9〕表明DDP等藥物可以引起腫瘤細胞發(fā)生自噬，說明自噬可能與腫瘤耐藥性存在一定的關系。本研究發(fā)現(xiàn)自噬抑制劑3－MA能夠顯著增強順鉑對肺癌A549細胞的殺傷作用。MDC是分析自噬過程特異性自噬溶酶體標記之一，通過MDC熒光染色可以發(fā)現(xiàn)DDP誘導肺癌A549細胞發(fā)生自噬，而3－MA和DDP聯(lián)合作用降低了細胞的自噬水平。流式細胞儀檢測細胞凋亡結果發(fā)現(xiàn)，3－MA和DDP聯(lián)合作用與單獨應用DDP相比，細胞凋亡率明顯增高。綜合分析以上結果表明DDP可以誘導肺癌A549細胞發(fā)生自噬和凋亡，抑制自噬可以增加細胞凋亡率，說明自噬在DDP誘導的肺癌A549細胞凋亡的過程中可能起到保護作用。此外有研究表明在DDP誘導肺癌A549耐藥細胞株中，3－MA可以增加DDP抑制細胞生長和凋亡作用;并且認為上調(diào)自噬在DDP誘導A549細胞耐藥機制中發(fā)揮主要作用〔7〕。而通過吖啶橙染色檢測自噬體的形成，在耐藥細胞中自噬體形成明顯減少，表明自噬能夠減少DDP誘導的細胞死亡〔10〕。

本研究發(fā)現(xiàn)DDP可以誘導肺癌A549細胞發(fā)生自噬。在化療過程中，通過抑制自噬表達，降低腫瘤細胞對受損細胞器的清除能力，增加腫瘤細胞的凋亡率，增加化療療效。

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