馬 旭 邵鳳明 (河南省人民醫(yī)院腎內(nèi)科，河南 鄭州 450003)

糖尿病腎病(DN)是糖尿病(DM)最為嚴(yán)重的慢性微血管并發(fā)癥之一，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和威脅患者的生命，但其發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚。研究提示，E-selectin介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)參與了DN發(fā)生發(fā)展，能增加尿蛋白，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，引起腎小球纖維化〔1，2〕。有學(xué)者觀察血管緊張素受體Ⅱ(AngⅡ)拮抗劑(ARB)通過抑制黏附分子合成而減輕腎小球炎癥〔3〕。本文旨在觀察替米沙坦對DM大鼠腎小球E-selectin表達(dá)的影響，從黏附分子角度探討替米沙坦對DN保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料:全自動(dòng)生化分析儀(美國Beckman公司，CX5CE);HIMAS-2000圖像分析系統(tǒng)(湖北千屏影像有限公司);STZ(美國Sigma公司，批號:BF1003);替米沙坦(德國勃林格殷格翰制藥有限公司);SP試劑盒(北京中山公司，);山羊抗大鼠ICAM-1和山羊抗大鼠VCAM-1抗體(Santa Cruz公司);Trizol試劑盒(美國GIBCO公司)。健康SD大鼠30只，雄性，體重(180±20)g(鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型的建立與分組 健康雄性SD大鼠，于左腎切除后1 w，大鼠禁食10 h后，單次腹腔注射50 mg/kg鏈脲質(zhì)毒素(STZ)，用0.1 mol/lL無菌檸檬酸緩沖液配制，pH4.5)。72 h后取尾靜脈血測血糖，尿糖試紙測尿糖。血糖≥16.7 mmol/L，尿糖(3+～4+)者選入DM大鼠模型〔2〕。正常對照組僅注射等量的檸檬酸緩沖液。DM大鼠隨機(jī)分成DM組10只;替米沙坦組R組10只;正常對照組C組替米沙坦10只。各組以替米沙坦5 mg·kg－1·d－1ig給藥;其他兩組每天同體積生理鹽水灌胃。所有大鼠在整個(gè)灌胃期間均飼以標(biāo)準(zhǔn)飲食，不使用胰島素。12 w后處死并收集3 ml下腔靜脈血及處死前24 h尿，留取右側(cè)腎臟，稱重，部分腎組織以10%甲醛固定，其余組織置于－80℃冰箱中凍存。

1.2.2 生化檢查 留24 h尿檢測尿蛋白定量。血標(biāo)本檢測血糖、血肌酐。并計(jì)算左腎重與體重之比。

1.2.3 腎組織病理學(xué)檢查 腎小球PAS染色及病理程度分析:常規(guī)固定、包埋、3 μm切片PAS染色。高倍鏡下順序觀察，每張切片觀察5個(gè)腎小球，每組5張切片，用HIMAS-2000圖像分析系統(tǒng)定量測量每個(gè)腎小球面積(GA)，腎小球內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)面積(ECM)，結(jié)果用ECM/GA表示，代表腎小球增生程度。

1.2.4 免疫組化 采用SP法。腎臟標(biāo)本固定，石蠟包埋切片，分別按試劑盒說明進(jìn)行E-selectin染色。再由兩位免疫病理人員對染色標(biāo)本進(jìn)行評定并觀察陽性細(xì)胞在腎小球內(nèi)的分布。利用HIMAS-2000病理圖像分析系統(tǒng)，測定E-selectin陽性著色的平均灰度×面積比。對E-selectin進(jìn)行半定量分析。

1.2.5 腎組織總蛋白提取和Western-印跡檢測 稱取100 mg腎組織，剪碎，1 ml蛋白裂解液(50 mmol/L Tris〔pH7.5〕，150 mmol/L NaCl，5 mmol/L MgCl2，5 mmol/L EDTA，0.5%NP40，1 mmol/L PMSF，20 μg/ml Aprotintin)中勻漿后考馬斯亮藍(lán)G250測蛋白濃度。取腎組織蛋白100 μg經(jīng)10%的SDSPAGE凝膠電泳后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST溶液4℃封閉過夜，加入山羊抗大鼠E-selectin 4℃過夜，再用AP標(biāo)記的兔抗山羊IgG進(jìn)行雜交，洗膜后進(jìn)行NBT/BCIP顯色。雜交結(jié)果MGIAS-1000凝膠成像分析系統(tǒng)測量吸光度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 利用SPSS13.0軟件，計(jì)量數(shù)據(jù)用表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生化、腎重及病理改變 與正常對照組相比，DM組及替米沙坦組大鼠血糖、蛋白尿定量、血清肌酐均顯著性升高(P＜0.01)。與DM組相比，替米沙坦組大鼠蛋白尿定量與血清肌酐顯著降低(P＜0.01)，血糖無明顯變化。與正常對照組相比，DM組大鼠腎臟重量增大，替米沙坦組腎重小于DM組并大于正常對照組，但無顯著性意義。見表1。大鼠腎組織光鏡下可見DM組及替米沙坦組腎小球部分體積增大，系膜區(qū)有不同程度增生，間質(zhì)可見中性粒及單核淋巴細(xì)胞浸潤，正常對照組未見明顯異常。見圖1和圖2。

表1 各組大鼠血、尿生化結(jié)果(，n=10)

表1 各組大鼠血、尿生化結(jié)果(，n=10)

與正常對照組相比:1)P＜0.05，2)P＜0.01;與DM組相比:3)P＜0.05，4)P＜0.01

組別 血糖(mmol/L) 尿蛋白(mg/d) 血清肌酐(μmol/L) ECG/GA 腎重/體重(×10－3)正常對照組 5.46±0.79 10.50±2.48 58.69±12.63 0.21±0.034.70±0.67 DM組 22.38±2.371) 59.03±11.371) 152.12±18.631) 0.63±0.041) 8.92±0.851)替米沙坦組 20.50±1.731) 38.21±3.71)2) 89.09±12.393)4) 0.41±0.033)4) 7.66±1.001)

圖1 各組腎臟病理結(jié)果(PAS，×400)

圖2 各組E-selectin免疫組化檢測結(jié)果(×10)

2.2 E-selectin免疫組化及Western印跡結(jié)果 E-selectin免疫組化及Western印跡結(jié)果示表達(dá)呈相同趨勢，與正常對照組比較，DM組及替米沙坦組E-selectin表達(dá)增加(P＜0.01)，但R組表達(dá)顯著低于DM組(P＜0.01)。見表2，見圖3。

表2 各組大鼠E-selectin免疫組化及Western印跡結(jié)果(，n=6)

表2 各組大鼠E-selectin免疫組化及Western印跡結(jié)果(，n=6)

與正常對照組相比:1)P＜0.01;與DM組相比:2)P＜0.01

組別 免疫組化 Western 0.18±0.06 0.02±0.03 M組 2.13±0.181) 0.23±0.261)R組 1.18±0.261)2) 0.07±0.181)2)印跡C組

圖3 各組E-selectin免疫印跡結(jié)果

3 討論

本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ统晒Γc文獻(xiàn)〔4〕基本一致，大鼠尚處于DN早期。DN時(shí)白細(xì)胞在腎小球和腎間質(zhì)的浸潤是DN組織的特征性表現(xiàn)之一，并在腎小球硬化方面起重要作用。Hirata等〔5〕發(fā)現(xiàn)在DN患者中，E-selectin沿腎小球毛細(xì)血管及系膜區(qū)分布，DN組與其他腎病組(微小病變性腎病、膜性腎病、狼瘡腎炎等)比較，腎組織中E-selectin表達(dá)增加有顯著意義。由此認(rèn)為E-selectin介導(dǎo)的腎小球、間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤可能是間質(zhì)纖維化、細(xì)胞外基質(zhì)增生、腎小球硬化的重要機(jī)制。Narumi等〔6〕通過原位雜交的方法檢測DNkk-ay小鼠腎小球E-selectin表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與對照組比較，E-selectin表達(dá)明顯增加，說明E-selectin可能參與DN的發(fā)生發(fā)展。同時(shí)，Tailor等〔7〕發(fā)現(xiàn)在伴有微血管并發(fā)癥〔DM視網(wǎng)膜病變(DR)和(或)DN〕的DM患者血清中可溶性E-selectin水平明顯高于無糖尿病微血管并發(fā)癥的患者。另外，Shestakora等〔8〕發(fā)現(xiàn)在不同階段1型DM患者中，有DR、微量或大量蛋白尿患者的血循環(huán)E-selectin水平明顯要比沒有這些病變患者的高，而且增加的水平與患者的性別、血中膽固醇及甘油三酯的水平與明顯關(guān)系。由此可見E-selectin是DN發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明E-selectin可能在高糖狀態(tài)下被激活，E-selectin屬于黏附分子中選擇素家族，主要分布于內(nèi)皮細(xì)胞和系膜細(xì)胞，通過識別特異性的碳水化合物基團(tuán)介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞與單核/巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的黏附，從而有助于這些炎癥細(xì)胞游走到腎小球，產(chǎn)生一系列的細(xì)胞因子參與DM微血管病變的發(fā)生發(fā)展〔9，10〕。許多研究表明，內(nèi)皮功能損傷與DM微血管病變的發(fā)生緊密相連，而Bernd等〔11〕發(fā)現(xiàn)黏附分子介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞與白細(xì)胞的相互作用在內(nèi)皮損傷的發(fā)生發(fā)展中占重要地位。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了E-selectin在DN發(fā)展中的作用。

有研究證實(shí)腎素-血管緊張素系統(tǒng)參與了DN的進(jìn)展，其中AngⅡ起重要作用〔12，13〕。DM時(shí)高血糖使腎素-血管緊張素系統(tǒng)活性增高，尤其是腎組織中AngⅡ含量增加，導(dǎo)致血管通透性增加，炎癥細(xì)胞浸潤〔14〕。替米沙坦作為半衰期最長的受體拮抗劑，能夠持久平穩(wěn)地抑制AngⅡ，從而減少炎癥因子的表達(dá)、腎小球系膜炎癥細(xì)胞的浸潤〔15〕。

替米沙坦是一種高活性高選擇性的AngⅡ受體拮抗劑，AngⅡ通過與血管、腎臟、心臟、腎上腺上的AT1受體結(jié)合發(fā)揮其作用。本實(shí)驗(yàn)提示替米沙坦可直接或間接通過降低E-selectin表達(dá)來改善DM大鼠腎臟病變。但替米沙坦究竟是通過哪些環(huán)節(jié)影響E-selectin的表達(dá)，有待于進(jìn)一步闡明。

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