李 涵 趙玉蘭 張 強(qiáng) (鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，河南 鄭州 450014)

心肌肥厚是多種心血管疾病的共同病理過(guò)程，其發(fā)生的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)主要是心肌細(xì)胞增大和纖維化。其過(guò)程包括了心肌細(xì)胞肥大和間質(zhì)成分改變，亦可稱為心肌重構(gòu)。心肌重構(gòu)最終導(dǎo)致冠脈血流儲(chǔ)備減少，增加心肌缺血，從而導(dǎo)致心衰、心律失常、猝死等。目前多項(xiàng)研究表明，細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)尤其是Ⅰ型和Ⅲ型膠原纖維的異常改變，在心肌重構(gòu)中起重要作用。細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的改建，尤其是心肌膠原的沉積與心肌細(xì)胞肥大不同步發(fā)展是促使心肌肥厚由代償向失代償轉(zhuǎn)變的主要原因之一〔1〕。多項(xiàng)研究已經(jīng)證明心肌重構(gòu)的產(chǎn)生與腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)有關(guān)。奧美沙坦作為ARB類(lèi)藥物可完全阻斷血管緊張素Ⅱ與其受體的結(jié)合，從而抑制心肌重構(gòu)。本實(shí)驗(yàn)建立心肌肥厚大鼠模型，觀察大鼠心肌中MMP-1、MMP-3的表達(dá)水平，并用奧美沙坦進(jìn)行干預(yù)，為奧美沙坦改善心肌重構(gòu)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 由鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供雄性Wistar大鼠300～350 g 30只，隨機(jī)分為對(duì)照組(甲組)、模型組(乙組)、干預(yù)組(丙組)，每組10只，三組間重量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 心肌肥厚模型制備 (1)三組均于大鼠背部皮下注射，甲組按3 ml·kg－1·d-1注射生理鹽水，每天 2次，連續(xù) 10 d。乙組、丙組按3 mg·kg－1·d－1注射異丙腎上腺素，每天2次，連續(xù) 10 d，同時(shí)甲、乙組生理鹽水灌胃 1 ml/d，丙組按10 mg·kg－1·d－1奧美沙坦灌胃一次，連續(xù) 10 d。(2)三組大鼠10 d用藥后稱其重量，再將各組用10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉，開(kāi)胸取心臟，稱取全心濕重及左心室濕重。左心室一部分心肌標(biāo)本保存在液氮中，用于提取RNA進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR，另一部分置于100 g/L多聚甲醛中固定，常規(guī)石蠟包埋切片(5 μm)。

1.3 HE染色 將取出的心臟標(biāo)本置4%多聚甲醛固定24 h(4℃)，常規(guī)石蠟包埋，沿左室長(zhǎng)線每隔1 mm橫斷面切取數(shù)張5 μm 厚，HE 染色。

1.4 心肌肥厚組織MMP-1、MMP-3 mRNA的測(cè)定 實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定肥厚心肌MMP-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)。①總RNA的提取。將在液氮中凍存的樣品取出后剪碎，使用TRIzol試劑盒提取總RNA(步驟詳見(jiàn)說(shuō)明書(shū))。②cDNA的合成。1 μl總RNA通過(guò)隨機(jī)引物M-MLV以15 μl體系逆轉(zhuǎn)錄生成所需cDNA。③實(shí)時(shí) PCR。MMP-1 的參數(shù)為94℃3 min，94℃ 30 s，72℃1 min，72℃5 min，40個(gè)循環(huán)。依據(jù)擴(kuò)增長(zhǎng)度配制1.5%瓊脂糖凝膠(50 ml)，微波爐加熱前加入核酸凝膠染色劑GelRed 5 μl(即稀釋至1∶10 000)，冷卻后制膠，取 5 μl PCR 產(chǎn)物加1.0 μl上樣緩沖液(0.25%溴芬藍(lán)，40%蔗糖)，穩(wěn)壓電泳80 V約40 min。凝膠在UVP凝膠成像系統(tǒng)中掃描觀察結(jié)果、拍照，采用圖像分析軟件BandScan5.0分析電泳條帶的光密度值，計(jì)算MMP-1內(nèi)參的光密度積分值比值作為MMP-1的相對(duì)表達(dá)量。MMP-3測(cè)定參照MMP-1。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)算資料以表示，組間資料采用單因素方差分析及LSD檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 三組大鼠體重，心臟重量，左室重量，左室重量指數(shù)比較

見(jiàn)表1。三組實(shí)驗(yàn)大鼠體重差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，乙組、丙組的左室重量、心臟重量、左室重量指數(shù)都高于甲組(P＜0.05)，丙組左室重量、心臟重量、左室重量指數(shù)均低于乙組(P＜0.05)。

表1 各組大鼠左室重量、心臟重量、左室重量指數(shù)和體重的比較(，n=10)

表1 各組大鼠左室重量、心臟重量、左室重量指數(shù)和體重的比較(，n=10)

與甲組比較:1)P＜0.05;與乙組比較:2)P＜0.05;下表同

組別 左室重量(mg)心臟重量(mg)左室重量指數(shù)(mg/g)10 d后體重(g)甲組 614.44±4.92 753.89±9.31 1.78±0.01 344.97±5 344.48±1.63.46乙組 867.25±3.911) 970.05±5.541) 2.47±0.021) 350.83±2.91丙組760.83±4.251)2)874.56±6.611)2)2.20±0.011)2)

2.2 三組大鼠心肌組織病理改變 對(duì)照組小鼠心肌細(xì)胞排列整齊，模型組和干預(yù)組與對(duì)照組相比心肌細(xì)胞均有肥大現(xiàn)象，心肌間隙增寬，且模型組較干預(yù)組更為明顯。

對(duì)照組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，排列整齊;模型組細(xì)胞明顯肥大且排列不規(guī)則，心肌組織中纖維結(jié)締組織增生;干預(yù)組大鼠的心肌細(xì)胞亦有病理?yè)p傷，但損傷程度較模型組輕。見(jiàn)圖1。

2.3 三組大鼠心肌MMP-1、MMP-3 mRNA表達(dá)的比較 見(jiàn)表2，圖2。乙組、丙組MMP-1、MMP-3 mRNA表達(dá)高于甲組(P＜0.05)，乙組高于丙組(P＜0.05)。

表2 各組大鼠心肌細(xì)胞MMP-1、MMP-3 mRNA的表達(dá)(，n=10)

表2 各組大鼠心肌細(xì)胞MMP-1、MMP-3 mRNA的表達(dá)(，n=10)

組別MMP-1 MMP-3甲組0.107±0.009 0.084±0.007乙組 0.626±0.037 0.405±0.024丙組0.313±0.018 0.196±0.013

圖1 三組大鼠心肌組織病理改變(HE，×100)

圖2 三組大鼠MMP-1、MMP-3 mRNA表達(dá)

3 討論

心肌肥厚是心臟對(duì)慢性壓力或容量超負(fù)荷產(chǎn)生的靶器官反應(yīng)，是一種極其重要的、獨(dú)立的心血管危險(xiǎn)因素，可使心肌缺血、心律失常、心力衰竭和猝死的幾率增加6～10倍。本實(shí)驗(yàn)用異丙腎上腺素建立大鼠心肌肥厚模型〔2〕，建模10 d后通過(guò)病理學(xué)觀察，模型組和干預(yù)組心肌細(xì)胞明顯肥大，左室重量及左室重量指數(shù)均明顯高于對(duì)照組。

ECM圍繞在心肌細(xì)胞周?chē)?，可保護(hù)心臟功能及結(jié)構(gòu)的完整性。心肌肥厚的過(guò)程主要包括心肌細(xì)胞的肥大和間質(zhì)的纖維化，初期的心肌肥厚有一定的代償意義，但隨著心肌間質(zhì)成纖維細(xì)胞的增殖，細(xì)胞外基質(zhì)只要是Ⅰ型和Ⅲ型膠原纖維沉積異常增加，是心肌結(jié)構(gòu)的功能發(fā)生重塑，最終導(dǎo)致冠脈血流儲(chǔ)備減少，增加心肌缺血，從而引起心力衰竭、心律失常、猝死等。MMPs是水解ECM的蛋白裂解酶，主要由膠原構(gòu)成。MMPs的表達(dá)和活性增強(qiáng)，可導(dǎo)致正常心肌膠原蛋白過(guò)度降解，并被缺乏連接結(jié)構(gòu)的纖維間質(zhì)取代，使心臟組織重構(gòu)，最終導(dǎo)致心功能惡化。MMP-1可降解變性的膠原，MMP-3可作用于Ⅲ型、Ⅳ型膠原及明膠。MMP-1和MMP-3的表達(dá)水平可間接反映心肌肥厚程度。

心肌重構(gòu)過(guò)程中，RAAS發(fā)揮著很重要的作用，血管緊張素Ⅱ是RAAS中最重要的效應(yīng)因子，可作用于間質(zhì)細(xì)胞和心肌細(xì)胞啟動(dòng)重構(gòu)。血管緊張素受體包含兩種不同的亞型，AT1和AT2，AngⅡ作用于心肌細(xì)胞的AT1受體，使心肌細(xì)胞蛋白合成增加、心肌肥大，與心肌重塑相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)，同時(shí)還可促進(jìn)心肌細(xì)胞的凋亡。AngⅡ作用于心臟成纖維細(xì)胞的AT1受體，誘導(dǎo)組織纖維化，膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ合成增加，從而刺激MMP-1和MMP-3的表達(dá)和活性增強(qiáng)，導(dǎo)致正常心肌膠原蛋白過(guò)度降解，心臟組織重構(gòu)。ARB是AT1受體的無(wú)活性配體，可以與AngⅡ競(jìng)爭(zhēng)AT1的結(jié)合位點(diǎn)〔3〕。因此，ARB藥物的作用都是阻斷RAAS，減少AngⅡ并抑制其與配體的結(jié)合，從而達(dá)到抑制心肌重塑的目的。本試驗(yàn)使用ARB類(lèi)藥物奧美沙坦對(duì)心肌肥厚大鼠進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示干預(yù)組的左室重量、心臟重量、左室重量指數(shù)均低于模型組，為奧美沙坦抗心肌肥厚機(jī)制提供了理論依據(jù)。

1 Berenji K，Drazner MH Rothermel BA，et al.Does load-induced ventricular hypertrophy progress to systolic heart failure〔J〕?Am J Physiol Heart Circ Physiol，2005;289(1):H8-H16.

2 White P，Brestelli JE，Kaestner KH，et al.Identification of transcription networks during liver regeneration〔J〕.J Biol Chem，2005;280(5):3715-22.

3 馬曉慶，蘇勝偶.內(nèi)皮素、血管緊張素Ⅱ、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子p1與心肌肥厚關(guān)系的研究進(jìn)展〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2009;9(6);767-8.