何曉玲 / 福建省晉江市質(zhì)量計(jì)量檢測(cè)所

0 引言

甜蜜素（Sodium cyclamate）化學(xué)名稱(chēng)為環(huán)己基氨基磺酸鈉，分子結(jié)構(gòu)式為C6H11NHSO3Na，是一種人工合成的甜味劑，味道清甜，甜度為蔗糖的40～50倍，為無(wú)營(yíng)養(yǎng)甜味劑。作為人工合成甜味劑，甜蜜素被廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)，如飲料、蜜餞、糕點(diǎn)等食品中。由于有研究表明甜蜜素可能在腸菌作用下分解為有慢性毒性的環(huán)己胺，可能導(dǎo)致膀胱癌，所以美國(guó)、英國(guó)、加拿大、日本等國(guó)禁止使用甜蜜素作為食品添加劑，我國(guó)對(duì)甜蜜素的使用也有強(qiáng)制限量的規(guī)定[1]。

目前已建立的食品中甜蜜素檢測(cè)方法主要有：氣相色譜法[2，3]、比色法[4]、薄層層析法[5]、高效液相色譜法[6]、氣質(zhì)聯(lián)用法[7]、液質(zhì)聯(lián)用法[8]等。比色法和薄層層析法操作較為繁瑣且靈敏度不高，已基本不使用；氣相色譜法的衍生產(chǎn)物不穩(wěn)定，易分解，且保存條件苛刻；氣質(zhì)聯(lián)用法和液質(zhì)聯(lián)用法操作簡(jiǎn)單、檢出限低，但儀器昂貴，不適合作為基層檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)日?？焖贆z測(cè)使用方法；近年來(lái)液相色譜法檢測(cè)甜蜜素日益受到研究人員的關(guān)注并進(jìn)行了相關(guān)報(bào)道，其衍生產(chǎn)物常溫下性質(zhì)穩(wěn)定，靈敏度高，檢出限低，儀器要求不高，檢測(cè)過(guò)程簡(jiǎn)單方便，目前尚未見(jiàn)有關(guān)含乳飲料基質(zhì)中甜蜜素檢測(cè)方法的報(bào)道。本文通過(guò)優(yōu)化含乳飲料中甜蜜素液相檢測(cè)方法的前處理過(guò)程，建立了柱前衍生-高效液相色譜法分離檢測(cè)含乳飲料中甜蜜素的方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器

2695高效液相色譜儀（美國(guó)waters公司），配有2998 PDA檢測(cè)器、四元泵、在線(xiàn)真空脫氣機(jī)、柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器；320R離心機(jī)（德國(guó)Hettich公司）；AXL阿修羅實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī)；0.45μm尼龍濾膜（津騰）。

1.2 試劑

甲醇，乙腈（HPLC級(jí)，沃凱）；其余試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。正己烷（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；乙酸鉛溶液（22 g/L），次氯酸鈉溶液（1 ： 1），硫酸溶液（1 ： 1）；碳酸氫鈉溶液（10%），氯化鈉（西隴化工股份有限公司）。

甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（純度99.8%，北京上立方聯(lián)合化工技術(shù)研究院）。

1.3 色譜分析條件

色譜柱：Waters SunFire C18 （4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇：水= 85 ： 15；檢測(cè)波長(zhǎng)：311 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

1.4 樣品處理

稱(chēng)取混勻后的含乳飲料樣品10 g，緩慢加入3.0 mL乙酸鉛溶液，搖勻，靜置30 min，6 000 rpm離心15 min后過(guò)濾，取上清液加入1.0 mL硫酸溶液，搖勻后加入2.0 mL次氯酸鈉溶液，振搖2 min，加入2 g氯化鈉和5.0 mL正己烷，振搖2 min后靜置分層，取正己烷層加入20.0 mL碳酸氫鈉溶液充分振搖，取正己烷層經(jīng)0.45 μm膜過(guò)濾后進(jìn)液相色譜進(jìn)行分析。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

1.5.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液

準(zhǔn)確稱(chēng)取甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)品100.0 mg溶于超純水并定容至100.0 mL容量瓶中，作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，濃度為1.0 mg/mL，臨用前用超純水稀釋。

1.5.2 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液

使用前用超純水稀釋為0.01 mg/mL、0.02 mg/mL、0.05 mg/mL、0.10 mg/mL、0.20 mg/mL、0.50 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.5.3 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)測(cè)定

分別吸取10.0 mL甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，加入1.0 mL硫酸溶液，搖勻后加入2.0 mL次氯酸鈉溶液，振搖2 min，加入2 g氯化鈉和5.0 mL正己烷，振搖2 min后靜置分層，取正己烷層加入20.0 mL碳酸氫鈉溶液充分振搖，分層后取正己烷層經(jīng)0.45 μm膜過(guò)濾后進(jìn)液相色譜進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品預(yù)處理方式選擇

甜蜜素穩(wěn)定性好，對(duì)熱、光、空氣、酸、堿均穩(wěn)定，不溶于乙醇、乙醚、苯和氯仿等，在水中的溶解度大，能達(dá)到200 g/kg。本實(shí)驗(yàn)的樣品基質(zhì)是蛋白質(zhì)、固形物，食品添加劑豐富的含乳飲料，蛋白質(zhì)的大量存在影響衍生產(chǎn)物的萃取過(guò)程，產(chǎn)生大量難以消解的泡沫，萃取分層困難，所以在前處理方法中重點(diǎn)考察甜蜜素與蛋白質(zhì)、固形物等的分離。

本實(shí)驗(yàn)選取乙酸鉛溶液、三氯乙酸溶液對(duì)樣液進(jìn)行預(yù)處理，6 000 rpm離心15 min取上清，三氯乙酸溶液沉淀效果不佳，故排除。考察含乳飲料加標(biāo)，經(jīng)乙酸鉛溶液前處理后，離心取上清液，按1.5.3 加入1.0 mL硫酸溶液等步驟進(jìn)行檢測(cè)，選取乙酸鉛溶液作為樣品中蛋白質(zhì)及其他大分子極性物質(zhì)沉淀劑。其沉淀效果好、速度快、不影響目標(biāo)產(chǎn)物回收率。

2.2 衍生化方法的優(yōu)化

衍生效率直接影響方法的回收率和精密度，故本實(shí)驗(yàn)著重對(duì)甜蜜素的柱前衍生方法進(jìn)行了優(yōu)化，主要考察衍生處理中的pH、衍生劑加入量、正己烷加入量、氯化鈉加入量、碳酸氫鈉加入量等參數(shù)對(duì)于衍生效果的影響。

2.2.1 pH

本實(shí)驗(yàn)的衍生反應(yīng)是在強(qiáng)酸性條件下進(jìn)行的，所以首先研究pH對(duì)衍生化效果的影響。取3份濃度為0.50 mg/mL的甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)工作溶液10.0 mL，分別加入1.0 mL、3.0 mL、5.0 mL硫酸溶液，按1.5.3方法進(jìn)行檢測(cè)，由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知當(dāng)硫酸溶液加入量為1.0 mL時(shí)，已能滿(mǎn)足衍生反應(yīng)條件要求。

2.2.2 衍生劑加入量

本實(shí)驗(yàn)的衍生劑是次氯酸鈉，故次氯酸鈉加入量直接影響到衍生反應(yīng)是否能進(jìn)行得完全。取5份10.0 mL濃度為0.50 mg/mL的甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按1.5.3方法進(jìn)行檢測(cè)，其中衍生劑加入量分別為0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、5.0 mL 次氯酸鈉溶液，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1，表明衍生劑加入量為2.0 mL時(shí)已能滿(mǎn)足衍生反應(yīng)要求。

圖1 衍生劑加入量

2.2.3 正己烷加入量

本實(shí)驗(yàn)的萃取溶劑是正己烷，取4份10.0 mL濃度為0.50 mg/mL的甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按1.5.3方法進(jìn)行檢測(cè)，其中正己烷的加入量分別為2.5 mL、5.0 mL、7.5 mL、10.0 mL，理論上正己烷的加入量應(yīng)與響應(yīng)值成反比，研究結(jié)果見(jiàn)圖2，表明當(dāng)正己烷加入量＜5.0 mL時(shí)，響應(yīng)值不成比例增加，說(shuō)明萃取效率降低。當(dāng)正己烷加入量≥5.0 mL時(shí)，響應(yīng)值隨著正己烷加入量的增加成比例減少，表明正己烷加入量為5.0 mL時(shí)已能滿(mǎn)足萃取衍生物的要求。若要減少正己烷用量，可用增加萃取次數(shù)來(lái)提高衍生物提取效率。

圖2 正己烷加入量

2.2.4 氯化鈉加入量

反應(yīng)中加入氯化鈉是為了增加鹽析，改善衍生物N，N-二氯環(huán)己胺在水相和有機(jī)相的分布，提高萃取效率。實(shí)驗(yàn)考察了氯化鈉在衍生反應(yīng)前添加、在反應(yīng)后添加和不添加三種情況，取3份10.0 mL濃度為0.50 mg/mL的甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按1.5.3方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明在衍生反應(yīng)后添加再進(jìn)行萃取既不影響衍生反應(yīng)產(chǎn)物的生成又能提高反應(yīng)效率。

2.2.5 碳酸氫鈉加入量

衍生反應(yīng)萃取后，用10%碳酸氫鈉溶液對(duì)正己烷層進(jìn)行洗滌的目的是為了中和過(guò)量的硫酸溶液和次氯酸鈉溶液，保護(hù)液相色譜管路和液相色譜柱的使用壽命。實(shí)驗(yàn)對(duì)此進(jìn)行了研究，結(jié)果表明碳酸氫鈉溶液加入量為15.0 mL時(shí)已能滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)要求。

2.2.6 優(yōu)化結(jié)果

經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，確定最佳的衍生化條件為：硫酸溶液加入量為1.0 mL，次氯酸鈉溶液加入量為2.0 mL，正己烷加入量為5.0 mL，氯化鈉在衍生反應(yīng)后添加再進(jìn)行萃取，碳酸氫鈉溶液加入量為15.0 mL。以下實(shí)驗(yàn)均按照最優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行。

2.3 儀器方法的選擇

2.3.1 測(cè)定波長(zhǎng)

甜蜜素在酸性條件下經(jīng)次氯酸鈉衍生，正己烷萃取的衍生物為N，N-二氯環(huán)己胺，對(duì)其在190～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)光譜掃描，發(fā)現(xiàn)在205.3 nm和311.8 nm處有強(qiáng)吸收峰，考慮到210 nm處流動(dòng)相中的甲醇和許多雜質(zhì)在此有強(qiáng)吸收干擾，故選擇311 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)（圖3）。

圖3 衍生物N，N-二氯環(huán)己胺紫外吸收光譜圖

2.3.2 流動(dòng)相

流動(dòng)相對(duì)樣品的分離有很大影響，實(shí)驗(yàn)比較了甲醇-水、乙腈-水兩種流動(dòng)相體系的分離效果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明兩者無(wú)明顯差別；實(shí)驗(yàn)考察0.02 mol/L乙酸銨代替水作為緩沖溶液對(duì)分離效果的影響，結(jié)果表明未見(jiàn)明顯差別，不影響色譜峰形，故測(cè)定時(shí)選用甲醇-水體系并通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定甲醇-水的配比為85 ： 15，甜蜜素衍生物的液相色譜圖見(jiàn)圖4。

圖4 甜蜜素衍生物N，N-二氯環(huán)己胺液相色譜圖

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程及相關(guān)系數(shù)

將1.5.2中制備好的甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)工作溶液按2.2.6方法進(jìn)行衍生化， HPLC測(cè)定，對(duì)峰面積和甜蜜素的質(zhì)量濃度進(jìn)行線(xiàn)性回歸，結(jié)果可知，甜蜜素在0.01～0.50 mg/mL范圍內(nèi)有良好的線(xiàn)性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.999 4。

本方法對(duì)含乳飲料中甜蜜素測(cè)定的最低檢出限為0.5 mg/kg。

2.5 回收率和精密度實(shí)驗(yàn)

采用含乳飲料基質(zhì)添加甜蜜素標(biāo)樣進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，所用的含乳飲料的本底不含甜蜜素的陰性樣品，分別添加20 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg，按照2.2.6方法進(jìn)行衍生化，HPLC進(jìn)行甜蜜素含量測(cè)定，計(jì)算甜蜜素回收率，每個(gè)水平進(jìn)行n = 6次重復(fù)試驗(yàn)，計(jì)算平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見(jiàn)表1，測(cè)定實(shí)際樣品的液相色譜見(jiàn)圖5。

表1 方法精密度和回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=6）

圖5 N，N-二氯環(huán)己胺液相色譜圖

2.6 穩(wěn)定性測(cè)試

將N，N-二氯環(huán)己胺的正己烷提取物放置于室溫（20～25℃）和冰箱（4℃）保存，第1 d、3 d、6 d分別測(cè)定其峰面積，響應(yīng)值均未見(jiàn)明顯變化，說(shuō)明N，N-二氯環(huán)己胺在室溫及（20～25℃）和冰箱（4℃）條件下是穩(wěn)定的。

3 結(jié)語(yǔ)

本文針對(duì)市售的含乳飲料進(jìn)行了前處理研究，對(duì)甜蜜素進(jìn)行了衍生化、萃取過(guò)程的優(yōu)化，建立了含乳飲料中快速檢測(cè)甜蜜素的高效液相色譜分析定量方法，衍生產(chǎn)物常溫下穩(wěn)定，檢出限低，方法精密度、回收率高，均符合日常檢測(cè)要求，對(duì)于其他基質(zhì)復(fù)雜的產(chǎn)品檢驗(yàn)有借鑒價(jià)值。

[1]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部. GB 2760-2011 [S]. 北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2011.

[2]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部. GB/T 5009.97-2003 [S]. 北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2003.

[3]洪曉峰. 氣象色譜法測(cè)定醬油中甜蜜素含量的探討[J]. 福建分析測(cè)試，2012, 21（2）：42-44.

[4]陳少波，潘超華. 食品中甜蜜素的紫外分光光度法測(cè)定[J]. 分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2000, 19（3）：82-83.

[5]劉維華，郭銀燕. 薄層層析法同時(shí)測(cè)定飲料中甜蜜素和糖精鈉[J]. 中國(guó)公共衛(wèi)生，2000, 16（8）：766.

[6]王敏，郭德華，韓麗，等. HPLC法快速分離和檢測(cè)食品中微量甜蜜素含量[J]. 中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2007, 8（17）： 1421-1422.

[7]胡強(qiáng)，王延云. 氣相色譜-質(zhì)譜法對(duì)不同食品中甜蜜素的測(cè)定[J].食品科學(xué)，2009, 30（14）：235-237.

[8]徐琴，牟志春，郝杰. 液相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定輸韓泡菜中的甜蜜素[J]. 食品科學(xué)，2012,33（04）：186-188.