陳明洪 ，尹 杰 ，鄧建文 ，吳苗苗 ，肖 昊 ，段杰林 ，方 俊 ，李鐵軍

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點實驗室，湖南省畜禽健康養(yǎng)殖工程技術(shù)中心，農(nóng)業(yè)部中南動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)觀測實驗站，湖南 長沙 410125；3.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；4.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，湖南 長沙 410128）

嘔吐毒素（vomitoxin）的主要成分是脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）。DON是一種單端孢霉烯族毒素，它是一種由鐮刀菌屬產(chǎn)生的毒性代謝產(chǎn)物，現(xiàn)已證實禾谷鐮刀菌和黃色鐮刀菌為主要產(chǎn)毒菌種[1]。DON在全球范圍內(nèi)廣泛存在，其在全世界范圍都具有較高檢出率[2-3]。由于DON在不同動物體內(nèi)有著不同的吸收、代謝、分布和排出的方式，因此不同動物對毒性敏感性也存在差異，其毒性作用大小依次為：豬、小鼠、大鼠、家禽和反芻動物[4]。嘔吐毒素能引起豬食欲下降、嘔吐、體重減輕、流產(chǎn)、死胎和弱仔等現(xiàn)象，抑制機體免疫力和降低抵抗力[5-6]。不僅如此，DON還具有細胞毒性和遺傳毒性，能抑制生物大分子如DNA、RNA、蛋白質(zhì)的合成[7]，誘導(dǎo)細胞發(fā)生凋亡[8-9]。目前有關(guān)DON脫毒處理主要為物理、化學(xué)和生物脫毒方法，而從營養(yǎng)角度的研究尚無報道。功能性氨基酸（如谷氨酸、精氨酸、賴氨酸等）是機體中腸道細胞、淋巴細胞等快速分裂細胞的主要氮源和能量來源，在疾病的預(yù)防、控制感染以及機體損傷后的修復(fù)等過程中具有營養(yǎng)和免疫調(diào)節(jié)雙重作用[10-12]。試驗研究了飼糧添加酸性氨基酸（谷氨酸、天冬氨酸）和堿性氨基酸（精氨酸、賴氨酸）對嘔吐毒素誘導(dǎo)的育肥豬臟器指數(shù)、血液常規(guī)指標和血液生化的損傷進行營養(yǎng)干預(yù)，以期從營養(yǎng)的角度為緩解嘔吐毒素的毒害作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

平均體重約為55 kg的二元雜（長×大）肥育豬30頭；F.graminearum R6576菌種（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)）；基礎(chǔ)飼糧配方參照NRC（1998豬營養(yǎng)需要標準（表1）；谷氨酸（Glu）、天冬氨酸（Asp）、精氨酸（Arg）、賴氨酸（Lys）。

1.2 飼糧處理

選用PDA培養(yǎng)基，121℃高壓蒸汽滅菌20 min，冷卻后在超凈工作臺接F.graminearum R6576菌種，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～6 d，將菌絲接種在羧甲基纖維素酯培養(yǎng)基（Carboxymethyl Cellulose，CMC）中，用接種針將菌絲打碎，1 L三角瓶中加入CMC液體培養(yǎng)基220 mL，置于28℃，200 r/min的恒溫振蕩搖床上培養(yǎng)5 d。將基礎(chǔ)飼糧平鋪于室內(nèi)，厚度適中，然后將處理好的每CMC液體培養(yǎng)基溶液按40 mL/kg均勻噴灑在基礎(chǔ)飼糧上，攪拌，混勻。處理過程中保持飼料含水量均勻且相對濕度在20%左右，溫度28℃左右，處理7 d。將處理好的飼糧與未處理的基礎(chǔ)飼糧按1∶1混合均勻，按試驗設(shè)計要求加入分別加入氨基酸。試驗周期為60 d，共處理飼料8次，每次每組取樣2份裝入干凈自封袋中，標記日期及組別，－20℃保存，用于檢測DON含量。

1.3 試驗設(shè)計

健康肥育豬30頭，隨機分為6組，每組5頭，每頭為1個重復(fù)。分別為：CK組（基礎(chǔ)飼糧）、DON組（飼糧添加3.4 mg/kg嘔吐毒素）、Glu組（3.4 mg/kg嘔吐毒素＋2%Glu）、Asp組（3.4 mg/kg嘔吐毒素＋2%Asp）、Arg組（3.4 mg/kg嘔吐毒素+1%Arg）和 Lys組（3.4 mg/kg嘔吐毒素＋1%Lys）。試驗育肥豬飼喂至出欄（60 d，體重100 kg左右）。

1.4 樣品采集及測定

1.4.1 血常規(guī)檢測 于屠宰前1 d，清晨對空腹育肥豬用無菌注射器前腔靜脈采血10 mL/頭。將血液靜置15 min，3000 r/min離心20 min分離血清，分裝于EPPendorf管中，4℃保存，待測。用血液分析儀（南昌百特HL-2400）進行白細胞計數(shù)（WBC）、淋巴細胞百分（LYMPH）、中間值細胞百分比（MID）、中性粒細胞百分比（GR）、淋巴細胞絕對值（LYMPH）、中間值細胞絕對值（MO）、紅細胞計數(shù)（RBC）、血紅蛋白（HGB）、紅細胞比積（HCT）、平均紅細胞體積（MCV）、紅細胞體積分布（RV）、平均血小板體積（MPV）、血小板壓積（PCT）和血小板分布寬度（PDW）等項目測定。

表1 基礎(chǔ)飼糧配方及營養(yǎng)水平 （%）

1.4.2 血清生化指標測定 同1.3.1采血樣，用BECKMAN公司CX4型全自動血液生化分析儀進行血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、白蛋白（ALB）、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶、總蛋白（TP）和血糖（GLU）等指標測定。

1.4.3 臟器指數(shù)測定 所有試驗育肥豬試驗60 d屠宰。打開腹腔，分離心臟、肝臟、脾臟和腎臟，稱重記錄數(shù)據(jù)。臟器指數(shù)=臟器絕對重量/體重（g/kg）。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)先用Excel 2003進行初步統(tǒng)計，然后用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析和Duncan氏多重比較，以P＜0.05為差異顯著性標準。試驗數(shù)據(jù)以平均值±標準誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 對臟器指數(shù)和肝臟形態(tài)學(xué)的影響

受嘔吐毒素的影響，心臟指數(shù)下降，其余臟器均有上升趨勢（見表2），但差異不明顯（P>0.05）。對于脾臟指數(shù)而言，添加1%的Lys較其余氨基酸組顯著下降（P＜0.05），但對于緩解嘔吐毒素對其影響效果不明顯（P>0.05），而酸性氨基酸與堿性氨基酸均能提高心臟、肝臟、脾臟和腎臟指數(shù)，從整體上來看，酸性氨基酸和堿性氨基酸對肥育豬臟器指數(shù)的緩解效果差異不顯著（P>0.05）。

2.2 對血液常規(guī)參數(shù)的影響

從表3中可知，與CK組相比，DON組白細胞數(shù)、中間值細胞百分比、中性粒細胞百分比、淋巴細胞絕對值、中間值細胞絕對值、血紅蛋白、平均紅細胞體積、平均血小板體積、血小板壓積均有所升高，其中平均血小板體積差異顯著（P＜0.05），其余差異不顯著。而與DON組比較，堿性氨基酸組中，添加1%Lys能顯著提高紅細胞數(shù)量（P＜0.05），而酸性氨基酸組的紅細胞數(shù)與DON組并無明顯差異。酸性氨基酸組中，添加2%Glu能顯著改善平均血小板體積（P＜0.05），而堿性氨基酸組的平均血小板體積與DON組差異不大，總體而言，4種氨基酸均能在一定程度上對嘔吐毒素誘導(dǎo)的肥育豬血液常規(guī)參數(shù)起到一定緩解作用，緩解效果的差異不顯著。

2.3 對血液生化指標的影響

肥育豬血液生化指標檢測結(jié)果見表4，與CK組比較，攝食嘔吐毒素的肥育豬血液中ALT含量有所下降，ALB、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶、TP和GLU均有不同程度上升，但差異均不明顯（P>0.05），與DON組比較，酸性氨基酸組中Asp組和堿性氨基酸組中Lys組均能呢能使ALT和γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶含量降低，且差異顯著（P<0.05），Glu組ALB酶含量顯著下降（P<0.05），Arg TP 含量顯著下降（P<0.05），Glu、Arg、Asp均對嘔吐毒素誘導(dǎo)的肥育豬GLU含量升高有一定的緩解效果，但效果不顯著（P>0.05）。

表2 氨基酸對嘔吐毒素誘導(dǎo)的肥育豬臟器指數(shù)的干預(yù)效應(yīng) （g/kg）

3 討論

3.1 對臟器指數(shù)的影響

動物臟器指數(shù)即動物的臟器重量與體重之比，是生物醫(yī)學(xué)研究的重要基礎(chǔ)指標[13]，它不僅是進行病理學(xué)、毒理學(xué)研究和探討發(fā)病機理等研究時選擇動物的依據(jù)[14]，而且能夠反映臟器本身的結(jié)構(gòu)改變及生理性功能狀態(tài)[15-17]。Wenkai指出[12]，功能性氨基酸在多種機體模型中均有緩解效果。試驗結(jié)果表明，與CK組比較，DON對肥育豬心臟指數(shù)的影響與伍力等[11]研究結(jié)果不同，導(dǎo)致這種現(xiàn)象的具體原因尚不清楚，可能是由于動物種類與毒素計量不一致導(dǎo)致。而與DON處理組比較，酸堿性氨基酸組肥育豬心臟、肝臟、脾臟和腎臟指數(shù)影響大多呈上升趨勢，且相比其他氨基酸組，添加1%Lys使脾臟指數(shù)下降。這一現(xiàn)象可能原因為人工處理的DON污染飼糧，毒性作用不強，肥育豬長時間食用含低劑量DON的日糧，對DON具有一定的耐受能力。

表3 氨基酸對嘔吐毒素誘導(dǎo)的肥育豬血常規(guī)參數(shù)的干預(yù)效應(yīng)

3.2 對血常規(guī)參數(shù)的影響

血液由液體和有形細胞兩大部分組成，血常規(guī)檢驗的是血液的細胞部分。血液不停地流動于機體循環(huán)系統(tǒng)中，參與機體的代謝及每一項功能活動，

表4 氨基酸對嘔吐毒素誘導(dǎo)的肥育豬血液生化指標的干預(yù)效應(yīng)

因此血液對保證機體的新陳代謝、功能調(diào)節(jié)以及內(nèi)外環(huán)境的平衡起重要作用。血液中的任何有形成分發(fā)生病理變化，都會影響到組織器官。Tiemann等[18]報道DON具有較強的細胞毒性，影響細胞增殖，從而導(dǎo)致細胞數(shù)量下降。趙青等[19]用DON標準品為原料，通過灌胃和靜脈注射2種給藥途徑，研究該毒素對豬體內(nèi)血常規(guī)指標的影響，發(fā)現(xiàn)2種方式均對豬血常規(guī)參數(shù)不會造成顯著影響。試驗中飼喂嘔吐毒素能刺激白細胞、中性粒細胞、淋巴細胞、中間值細胞、血紅蛋白的增值，但無顯著性差異，這一試驗結(jié)果與趙青等[19]人報道相符。平均血小板體積顯著上升，表明DON能夠引起肥育豬機體內(nèi)炎癥反應(yīng)，而添加2%Glu能使情況顯著改善。原因可能是由于谷氨酸能夠通過iNOS途徑在大腦組織中表達，間接調(diào)節(jié)動物免疫活性[20]，對平均血小板的作用還可能與Glu參與神經(jīng)調(diào)節(jié)有關(guān)。

3.3 對血液生化的影響

血液生理生化是反映動物機體生理機能的重要指標，也是臨床醫(yī)療和科學(xué)研究的重要依據(jù)[21]。何成華[22]分別用1和1.5 mg/kg DON對鯉魚進行攻毒，結(jié)果表明鯉魚血清中GOT、GPT和AKP活性上升，且GOT活性顯著上升，血清中TP、ALB含量是反映肝臟蛋白質(zhì)合成能力的重要指標。血清中TP含量反映了機體蛋白質(zhì)的吸收和代謝情況，并能反映體液免疫的情況。在DON的刺激下，肥育豬血液中ALT、ALB、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶、TP和GLU均出現(xiàn)不同程度上升，而γ-谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶和ALT是反映肝臟病變的兩個重要指標，TP和ALB也能夠一定程度上反映肝臟的合成功能，這說明嘔吐毒素已經(jīng)對肥育豬肝臟造成一定程度的損傷。而添加2%Glu和添加1%Lys能使ALT和r-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶含量顯著降低，添加2%Glu使ALB酶含量顯著下降，1%Arg使TP含量顯著下降。原因可能是動物長期進食含嘔吐毒素的飼糧使機體處于長時間應(yīng)激狀態(tài)，對肝臟解毒功能造成影響。添加的4種氨基酸都能顯著改善飼喂DON肥育豬的血液生化指標，調(diào)節(jié)肝功能障礙，對DON造成的負面影響有緩解效果。

4 結(jié)論

飼糧中添加3.4 mg/kg的嘔吐毒素對肥育豬臟器指數(shù)、血液常規(guī)指標和血液生化指標造成了不同程度的損傷，而添加酸性氨基酸（Glu、Asp）和堿性氨基酸（Arg、Lys）對于緩解臟器病變、改善血液生理生化指標具有一定的效果。

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