王立霞

（陜西學(xué)前師范學(xué)院，陜西西安710100）

環(huán)磷酸腺苷（Adenosine 3’，5’-cyclic monophosphate，簡(jiǎn)稱cAMP，結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1）普遍存在于哺乳動(dòng)物體內(nèi)，控制并調(diào)節(jié)細(xì)胞新陳代謝[1-3]，1957年由Sutherland發(fā)現(xiàn)。醫(yī)學(xué)研究證實(shí)至少40多種疾?。ò┌Y、高血壓、冠心病、心源性休克和心肌梗賽等重大疾病）與cAMP代謝有關(guān)，cAMP是棗中重要活性物質(zhì)。據(jù)報(bào)道，棗成熟果肉中cAMP含量為一般動(dòng)植物數(shù)千至數(shù)萬(wàn)倍，具重要開(kāi)發(fā)價(jià)值[4-7]。我國(guó)棗面積已達(dá)150萬(wàn)公頃，產(chǎn)量200萬(wàn)t，新疆和田地區(qū)憑借其獨(dú)特資源優(yōu)勢(shì)，近年棗業(yè)發(fā)展迅速，面積達(dá)30多萬(wàn)公頃[8]。本文作者已對(duì)不同產(chǎn)地、不同含水量、不同組織駿棗、灰棗中cAMP含量進(jìn)行研究，并得出結(jié)果和田玉棗（山西省交城縣駿棗引種于和田后其商品名稱為和田玉棗）中cAMP含量相對(duì)最高。關(guān)于cAMP的提取方法，以往多用傳統(tǒng)溶劑法，本研究引入了超聲波輔助法，并對(duì)這兩種方法進(jìn)行對(duì)比，以獲取超聲波輔助提取和田玉棗cAMP的最優(yōu)工藝參數(shù)。本研究成果為和田玉棗及其他棗品種cAMP深入研究及其開(kāi)發(fā)利用提供參考及理論依據(jù)。

圖1 環(huán)磷酸腺苷結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Structural of the cAMP

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅棗 新疆和田玉棗，系2012年10月中旬采摘后烘干的干棗，和田玉棗去核后經(jīng)40℃干燥，粉碎過(guò)60目篩，室溫下密封保存，待用；cAMP標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%）色譜純，德國(guó)Sigma公司；甲醇（純度為99.8%）色譜純，加拿大Promptar公司生產(chǎn)；其余試劑 均為分析純。

1525型高效液相色譜儀 美國(guó)Waters公司；TDL-5型低速大容量離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)；UV2550型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本Shimadzu公司；JY98-3D型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 高效液相色譜檢測(cè)條件 色譜柱：Brava-BDS C18（250mm×4.6mm，5μm）柱；流動(dòng)相：甲醇∶pH為3的雙蒸水（10∶90，V/V）；流速0.8mL/min；經(jīng)紫外全波長(zhǎng)掃描確定檢測(cè)波長(zhǎng)為257.0nm；溫度為室溫；進(jìn)樣量20μL[8-11]。

1.2.2 cAMP標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備及標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作精密稱取cAMP標(biāo)品2.5mg，置50mL容量瓶中，加流動(dòng)相至刻度，搖勻，得0.05mg/L cAMP標(biāo)品溶液。分別精密吸取標(biāo)品溶液1、2、3、4、5、6、7、8mL于10mL容量瓶中，加流動(dòng)相至刻度，搖勻，得5、10、15、20、25、30、35、40μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別精密吸取20μL系列標(biāo)品溶液注入色譜儀，記錄色譜圖，以濃度為橫坐標(biāo)，以cAMP峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得線性方程Y=21592x-4372.7（r=0.9999）[8-10]。

1.2.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)紅棗cAMP提取量的影響實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取和田玉棗粉2g，室溫下，分別以液料比15∶1用濃度為5%、15%、25%、35%、45%、55%乙醇溶解，每個(gè)水平重復(fù)3次。采用傳統(tǒng)溶劑浸提法提取，分別在40℃水浴中加熱10h，所得溶液離心、過(guò)濾、真空濃縮后用雙蒸水定容，過(guò)0.45μm濾膜，進(jìn)樣分析，依保留時(shí)間法對(duì)待分析組分進(jìn)行定性，以峰面積外標(biāo)法定量[8-9]。測(cè)定不同體積分?jǐn)?shù)乙醇中提取物的提取量（μg/g·dw（干重））。

1.2.4 超聲波提取條件對(duì)紅棗cAMP提取量的影響實(shí)驗(yàn) 經(jīng)文獻(xiàn)[12-15]研究可知，影響超聲波輔助提取效果的主要因素有超聲波提取功率、提取溫度、提取時(shí)間及液料比，因此先對(duì)以上4因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)分析，得出較理想的因素水平，然后再通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定最佳提取工藝參數(shù)[6-12]。除超聲波輔助提取功率單因素實(shí)驗(yàn)外，在進(jìn)行超聲波輔助法提取其他單因素實(shí)驗(yàn)的同時(shí)，與傳統(tǒng)溶劑法浸提實(shí)驗(yàn)進(jìn)行對(duì)比。

1.2.4.1 超聲波功率對(duì)紅棗cAMP提取量的影響實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確稱取和田玉棗粉2g，室溫下，以液料比15∶1加入15%乙醇溶液中，提取溫度40℃，分別在200、300、400、500、600、700W的功率下超聲30min，每個(gè)水平重復(fù)3次。分別測(cè)定提取物的提取量（μg/g·dw），確定最佳提取功率。

1.2.4.2 提取時(shí)間對(duì)紅棗cAMP提取量的影響實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確稱取和田玉棗粉2g，以液料比15∶1加入15%乙醇溶液中，固定超聲波提取溫度40℃，提取功率為400W，提取時(shí)間分別為 10、30、50、70、90、110min，每個(gè)水平重復(fù)3次。分別測(cè)定提取物的提取量（μg/g·dw），確定最佳提取時(shí)間。

1.2.4.3 提取溫度對(duì)紅棗cAMP提取量的影響實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確稱取和田玉棗粉2g，以液料比15∶1加入15%乙醇溶液中，固定超聲波提取功率為400W，提取時(shí)間為50min，提取溫度分別為25、35、45、55、65、75℃，每個(gè)水平重復(fù)3次。分別測(cè)定提取物的提取量（μg/g·dw），確定最佳提取溫度。

1.2.4.4 液料比對(duì)紅棗cAMP提取量的影響實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取和田玉棗粉2g，分別以液料比10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1加入15%乙醇溶液中，固定超聲波提取功率為400W，提取時(shí)間為50min，提取溫度為35℃，每個(gè)水平重復(fù)3次。分別測(cè)定提取物的提取量（μg/g·dw），確定最佳液料比。

1.2.4.5 正交實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上對(duì)超聲波提取溫度、提取時(shí)間、液料比、超聲波功率采用L9（34）正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)選，以確定最佳提取條件，因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 L9（34）實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 L9（34）Orthogonal factor level table

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)紅棗cAMP提取量的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)紅棗cAMP提取量的影響見(jiàn)圖2。圖2表明，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，cAMP的提取量呈先增大加后緩慢減小趨勢(shì)。在乙醇體積分?jǐn)?shù)為15%時(shí)，cAMP提取量達(dá)到最高，為542.33μg/g·dw，考慮能量節(jié)省及減少污染等因素，乙醇體積分?jǐn)?shù)以15%為宜。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)cAMP提取量的影響Fig.2 Effect of ethanol volume fraction on extracting content of cAMP

2.2 超聲波提取條件對(duì)紅棗cAMP提取量的影響

2.2.1 超聲波功率對(duì)紅棗cAMP提取量的影響 超聲波功率對(duì)紅棗cAMP提取量的影響見(jiàn)圖3。圖3表明，當(dāng)超聲波功率在200～400W時(shí)，cAMP提取量隨超聲波功率的增大而迅速增加，在功率為400～700W時(shí)，cAMP提取量分別為553.56、554.57、555.69、555.80μg/g·dw，提取量增加非常平緩。考慮到功率過(guò)大可能會(huì)影響物質(zhì)結(jié)構(gòu)，并加重設(shè)備負(fù)擔(dān)，因此選擇超聲波提取功率為400W。

圖3 超聲波提取功率對(duì)cAMP提取量的影響Fig.3 Effect of power of ultrasonic wave on extracting content of cAMP

2.2.2 提取時(shí)間對(duì)紅棗cAMP提取量的影響 提取時(shí)間對(duì)紅棗cAMP提取量的影響見(jiàn)圖4。圖4表明，同等條件下，超聲波輔助提取法較傳統(tǒng)溶劑法提取效率高，優(yōu)勢(shì)明顯。當(dāng)提取時(shí)間為10～50min時(shí)，兩種方法cAMP提取量均呈增加趨勢(shì)，提取時(shí)間為50min時(shí)，超聲波提取法提取量為559.92μg/g·dw；當(dāng)提取時(shí)間超過(guò)50min時(shí)，超聲波提取法cAMP提取量趨于平衡，考慮到時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)耗能及對(duì)儀器造成不良影響，故選擇超聲波輔助提取時(shí)間為50min。

圖4 提取時(shí)間對(duì)cAMP提取量的影響Fig.4 Effect of extracting time on extracting content of cAMP

2.2.3 提取溫度對(duì)紅棗cAMP提取量的影響 提取溫度對(duì)紅棗cAMP提取量的影響見(jiàn)圖5。圖5表明，同等條件下，超聲波輔助提取法較傳統(tǒng)溶劑法提取效率高，優(yōu)勢(shì)明顯。在超聲波輔助提取法中，cAMP提取量隨提取溫度的升高呈先增加后減少趨勢(shì)，當(dāng)提取溫度為35℃時(shí)，提取量最高，為678.58μg/g·dw，故選擇超聲波輔助提取溫度為35℃。

圖5 提取溫度對(duì)cAMP提取量的影響Fig.5 Effect of extracting temperature on extracting content of cAMP

2.2.4 液料比對(duì)紅棗cAMP提取量的影響 液料比對(duì)紅棗cAMP提取量的影響見(jiàn)圖6。圖6表明，同等條件下，超聲波輔助提取法較傳統(tǒng)溶劑法提取效率高，優(yōu)勢(shì)明顯。當(dāng)液料比低于25∶1時(shí)，cAMP提取量隨液料比的增加而快速增大，當(dāng)液料比為25∶1時(shí)，cAMP提取量為689.87μg/g·dw；高于25∶1時(shí)，cAMP的提取量趨于平衡。綜上分析，超聲波輔助提取樣品中cAMP的液料比以25∶1為宜。

圖6 液料比對(duì)cAMP提取量的影響Fig.6 Effect of liquid-solid ratio on extracting content of cAMP

2.2.5 正交實(shí)驗(yàn)按L9（34）進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果及數(shù)據(jù)處理見(jiàn)表2。由極差分析可知，各因素對(duì)cAMP提取量影響程度的大小順序?yàn)椋禾崛囟龋疽毫媳龋咎崛r(shí)間＞超聲波功率。和田玉棗中cAMP的最優(yōu)提取工藝為A2B2C1D2，提取溫度35℃、提取時(shí)間50min、液料比20∶1、超聲波功率400W。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Result of orthogonal experiment

表3 兩種提取方法比較Table 3 Comparison of different extraction methods

2.3 提取方法比較

采用傳統(tǒng)溶劑法[9]提取和田玉棗cAMP，并與2.2.5中得出的超聲波輔助提取法最優(yōu)工藝條件下的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。兩種方法的工藝條件及實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。表3顯示，超聲波輔助提取法提取效果明顯優(yōu)于傳統(tǒng)溶劑提取法。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)單因素和正交實(shí)驗(yàn)分析，確定了超聲波輔助提取和田玉棗cAMP的最優(yōu)工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)15%，提取溫度35℃、提取時(shí)間50min、液料比20∶1、超聲波功率400W。在此工藝條件下，和田玉棗cAMP平均提取量為771.95μg/g·dw；影響和田玉棗cAMP提取量的各因素的顯著順序?yàn)椋禾崛囟龋疽毫媳龋咎崛r(shí)間＞超聲波功率。

通過(guò)對(duì)兩種提取方法的比較，得知超聲波輔助法與傳統(tǒng)溶劑浸提法相比，具有提取速度快，提取量高，提取溫度低等明顯優(yōu)勢(shì)。

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