薩仁高娃，胡文忠，高春紅，姜愛(ài)麗，馮 可，馬 杰

(1.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧大連116034;2.大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，遼寧大連116600;3.大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧大連116024;4.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730070)

單核細(xì)胞增生李斯特菌(L.monocytogenes，LM)是一種常見(jiàn)的人畜共患的食源性致病菌，能引起人畜的李斯特菌?。?］，廣泛存在于自然界的土壤、水、植物和反芻動(dòng)物、人的糞便中，這種菌主要通過(guò)污染畜禽產(chǎn)品、蔬菜等食物而引起人類感染致病。由于該菌在4℃下的環(huán)境中仍可生長(zhǎng)與繁殖，冷藏食品成為引發(fā)食源性疾病的主要病源［2］。預(yù)測(cè)微生物學(xué)(predictive microbiology)是一門結(jié)合微生物學(xué)、化學(xué)、數(shù)學(xué)、統(tǒng)計(jì)學(xué)和應(yīng)用計(jì)算機(jī)技術(shù)的交叉性學(xué)科，它采用數(shù)學(xué)的方法描述不同環(huán)境條件下，細(xì)菌數(shù)變化和外部環(huán)境因素之間的響應(yīng)關(guān)系，并對(duì)微生物的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)做出預(yù)測(cè)［3］。國(guó)外根據(jù)預(yù)測(cè)微生物學(xué)開(kāi)發(fā)了多種預(yù)測(cè)模型軟件，其中，PMP(Pathogen Modeling Program)是由美國(guó)農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)研究所開(kāi)發(fā)的關(guān)于食品中微生物的生長(zhǎng)預(yù)測(cè)軟件，操作簡(jiǎn)捷，可用作微生物預(yù)測(cè)模型數(shù)據(jù)比較分析。目前，我國(guó)初步建立了LM的生長(zhǎng)預(yù)測(cè)模型，大多數(shù)簡(jiǎn)單建立LM在營(yíng)養(yǎng)肉湯、冷鮮畜禽肉及其制品上的生長(zhǎng)預(yù)測(cè)模型。國(guó)外研究較廣泛，建立了LM在畜禽及其制品，水產(chǎn)品和乳制品上的生長(zhǎng)模型，近幾年國(guó)外多次暴發(fā)因果蔬被LM污染而引起的食源性疾病，因此開(kāi)始建立LM在新鮮果蔬(如西瓜、木瓜［4］、卷心生菜［5］、蘆筍［6］等)上的生長(zhǎng)預(yù)測(cè)模型。雖然研究范圍擴(kuò)大，但國(guó)內(nèi)外對(duì)初始濃度對(duì)單增李斯特菌生長(zhǎng)的影響較少。本研究旨在建立不同溫度下不同初始濃度LM在營(yíng)養(yǎng)肉湯中的生長(zhǎng)預(yù)測(cè)模型，探究溫度和LM初始濃度對(duì)生長(zhǎng)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株 LM標(biāo)準(zhǔn)菌株來(lái)自遼寧省疾病控制中心;牛津瓊脂(OXA)基礎(chǔ) 青島海博生物技術(shù)有限公司，取 5.85g OXA，加熱溶解于100mL蒸餾水中，121℃高壓滅菌15min，冷至50℃時(shí)，加入1支牛津瓊脂添加劑(多粘菌素E 2mg、放線菌酮40mg、吖啶黃素0.5mg、頭孢雙硫唑甲氧 0.2mg、磷霉素 1mg)，混勻，傾入無(wú)菌平皿，備用;營(yíng)養(yǎng)肉湯(NB)青島海博生物技術(shù)有限公司，稱取18.0g NB，加熱溶解于1000mL蒸餾水中，分裝三角瓶或試管，121℃高壓滅菌15min，備用;含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆瓊脂(TSA－YE)青島海博生物技術(shù)有限公司，稱取51.0g TSA－YE，加熱溶解于1000mL蒸餾水中，121℃高壓滅菌15min，傾入無(wú)菌平皿，備用;實(shí)驗(yàn)用水 均為蒸餾水。

1300系列A2型二級(jí)生物安全柜 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司;HR40－IIA2二級(jí)生物安全柜青島海爾特種電器有限公司;MLS－3020全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌器 日本SANYO公司;PL2002分析天平瑞士METTLER TOLEDO公司;Acol－super全自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)儀 英國(guó)synbiosis公司;DNP－9052電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;HYC－326A醫(yī)用冷藏箱 青島海爾特種電器有限公司;YLE－1000電熱恒溫水浴鍋 北京東方精瑞科技發(fā)展有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原菌液的制備 在無(wú)菌室的生物安全柜里以無(wú)菌操作取TSA－YE斜面上的標(biāo)準(zhǔn)菌株，在TSA－YE無(wú)菌平板上平行劃線，36℃培養(yǎng)24～48h活化，挑取單菌落接種于含有150mL無(wú)菌NB的三角瓶中，充分混勻，將三角瓶放入36℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24～48h至初始菌落數(shù)大致為105cfu/mL，即原菌液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 營(yíng)養(yǎng)肉湯中LM計(jì)數(shù) 在無(wú)菌室中以無(wú)菌操作將原菌液充分混勻，取10mL加入到90mL無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)肉湯中，制得菌液濃度大致為104cfu/mL，再?gòu)?04cfu/mL中取10mL菌液加到90mL無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)肉湯中，制得菌液濃度大致為103cfu/mL，同樣方法，將菌液梯度稀釋102cfu/mL。將三個(gè)稀釋度的菌液均放入36℃培養(yǎng)，每隔2h將三個(gè)稀釋度菌液取出，搖勻后用涂布平板培養(yǎng)法［7］計(jì)活菌數(shù)，平板用全自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)儀分析計(jì)數(shù)，重復(fù)三次。按下列公式計(jì)算每毫升樣品中的含菌量:每毫升樣品中菌落形成單位(cfu)=同一稀釋度3次重復(fù)的平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×10。同樣方法將原菌液稀釋成104、103、102cfu/mL三個(gè)稀釋度，分別放入4℃和26℃培養(yǎng)，用平板涂布培養(yǎng)法計(jì)數(shù)。其中4℃每隔24或48h取一次計(jì)數(shù)，26℃每隔5h取一次計(jì)數(shù)。

1.2.3 初級(jí)模型構(gòu)建 初級(jí)模型利用Matlab軟件建立Gompertz模型和Logistic模型，選擇最合適的模型得出不同濃度LM菌懸液在不同溫度下的生長(zhǎng)曲線，并得到相應(yīng)的初級(jí)模型參數(shù)。生長(zhǎng)曲線和模型參數(shù)均與PMP預(yù)測(cè)軟件進(jìn)行比較。

式中:t表示時(shí)間(h)，Nt表示t時(shí)的菌數(shù)，A表示初始菌數(shù)N0(lg cfu/mL)，C表示最大菌數(shù)Nmax與初始菌數(shù)N0的差值(lg cfu/mL)，B為在時(shí)間點(diǎn)M時(shí)的相對(duì)最大生長(zhǎng)速率(h－1)，M表示達(dá)到最大生長(zhǎng)速率所需的時(shí)間(h)，U表示微生物生長(zhǎng)的最大比生長(zhǎng)速率(lg cfu/mL·h)，LPD表示微生物生長(zhǎng)的延滯期(h)，MPD表示微生物生長(zhǎng)的最大細(xì)胞密度(lg cfu/mL)，e=2.7182［8］。

2 結(jié)果與討論

2.1 LM在營(yíng)養(yǎng)肉湯中生長(zhǎng)的初級(jí)模型的選擇

不同濃度LM菌懸液的Gompertz模型在不同溫度下的擬合很好，相關(guān)系數(shù)均在0.98以上，Logistic模型擬合也較好，均在0.96以上，結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果顯示，不同濃度LM菌懸液在不同溫度下的生長(zhǎng)情況均能用Gompertz模型描述，因此選用Gompertz模型建立初級(jí)模型。

2.2 不同溫度下不同濃度LM在營(yíng)養(yǎng)肉湯中的生長(zhǎng)曲線

4℃下，Gompertz模型擬合的不同濃度LM在營(yíng)養(yǎng)肉湯中的生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖1。可以看出，初始菌濃度越低，菌的延滯期越短，較快進(jìn)入對(duì)數(shù)期，隨著初始菌濃度的增高，曲線趨于平緩，則延滯期時(shí)間增加。初始菌數(shù)為102、103cfu/mL的生長(zhǎng)曲線分別在約26、28h后進(jìn)入對(duì)數(shù)期。對(duì)數(shù)期LM的生長(zhǎng)速率隨著初始菌濃度的增加而減慢。最大菌體密度達(dá)到約104cfu/mL。

表1 不同濃度LM菌懸液的Gompertz模型和Logistic模型在不同溫度下的相關(guān)系數(shù)(R2)Table 1 The correlation coefficients(R2)of Gompertz model and Logistic model of the growth of L.monocytogenes under different temperatures and initial concentrations

圖1 4℃下Gompertz模型擬合的不同濃度LM在營(yíng)養(yǎng)肉湯中的生長(zhǎng)曲線Fig.1 Gompertz model curve of the growth of L.monocytogenes on nutrient broth under different concentrations at 4℃

26℃下，Gompertz模型擬合的不同濃度LM在營(yíng)養(yǎng)肉湯中的生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖2。菌的延滯期隨初始菌濃度的增加而縮短，初始菌濃度為102cfu/mL的曲線在約5h進(jìn)入對(duì)數(shù)期，而103和104cfu/mL的生長(zhǎng)曲線分別在約3和2h后就進(jìn)入了對(duì)數(shù)期。和4℃時(shí)一樣，進(jìn)入對(duì)數(shù)期的LM，生長(zhǎng)速率隨著初始菌濃度的增加而減慢，初始菌濃度越低，對(duì)數(shù)期菌數(shù)增加速率越快。25h后，三個(gè)不同菌濃度的生長(zhǎng)曲線達(dá)到最大菌體密度，約為105cfu/mL。

圖2 26℃下Gompertz模型擬合的不同濃度LM在營(yíng)養(yǎng)肉湯中的生長(zhǎng)曲線Fig.2 Gompertz model curve of the growth of L.monocytogenes on nutrient broth under different concentrations at 26℃

36℃下，Gompertz模型擬合的不同濃度LM在營(yíng)養(yǎng)肉湯中的生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖3。三個(gè)不同初始菌濃度的生長(zhǎng)曲線均在約1～2h后進(jìn)入對(duì)數(shù)期，LM的生長(zhǎng)延滯期隨初始菌濃度的增加而縮短。進(jìn)入對(duì)數(shù)期后，初始菌濃度越低，LM的生長(zhǎng)速率越快。約在8h后進(jìn)入穩(wěn)定期，細(xì)胞密度達(dá)到最大值，約107cfu/mL。

圖3 36℃下Gompertz模型擬合的不同濃度LM在營(yíng)養(yǎng)肉湯中的生長(zhǎng)曲線Fig.3 Gompertz model curve of the growth of L.monocytogenes on nutrient broth under different concentrations at 36℃

2.3 LM在營(yíng)養(yǎng)肉湯中生長(zhǎng)的初級(jí)模型的模型參數(shù)

由Matlab軟件擬合LM在營(yíng)養(yǎng)肉湯中生長(zhǎng)的Gompertz模型，得到相應(yīng)的生長(zhǎng)參數(shù):最大比生長(zhǎng)速率U(lg cfu/mL·h)、生長(zhǎng)延滯期LPD(h)和最大細(xì)胞密度MPD(lg cfu/mL)，結(jié)果見(jiàn)表2。

可以看出LM在4℃的最大比生長(zhǎng)速率(0.0236，0.0078，0.0016)小于在 26℃的最大比生長(zhǎng)速率(0.3169，0.1111，0.0595)，26℃的最大比生長(zhǎng)速率小于36℃的最大比生長(zhǎng)速率(1.3046，0.9287，0.7024)，證明隨著溫度升高，LM生長(zhǎng)速度加快。4℃下，最大比生長(zhǎng)速率隨著初始菌濃度的增加(102，103，104)而降低(0.0236，0.0078，0.0016)，26、36℃也顯示同樣的趨勢(shì)，結(jié)果證明，在相同溫度下，初始菌濃度越低，LM生長(zhǎng)越迅速。

隨著溫度的升高，生長(zhǎng)延滯期 LPD(h)縮短。LM在不同溫度下生長(zhǎng)延滯期順序?yàn)?4℃(25.6811，27.3143，33.7437)＞ 26℃(4.8442，3.3708，2.3458)＞36℃(1.7875，1.1932，0.6915)。在相同溫度下，生長(zhǎng)延滯期的趨勢(shì)并不明顯，26，36℃下，延滯期隨著初始菌濃度的增加而降低，而4℃下，延滯期隨著初始菌濃度的增加而延長(zhǎng)，因?yàn)闇囟容^高時(shí)(26，36℃)，初始菌濃度越大，進(jìn)入對(duì)數(shù)期就越快，延滯期越短;而溫度較低時(shí)(4℃)，初始菌濃度越大，越接近最大細(xì)胞密度，因此延滯期越長(zhǎng)。

從最大細(xì)胞密度MPD(lg cfu/mL)可以看出，隨著溫度升高，MPD增大，LM在不同溫度下的最大生長(zhǎng)密度順序?yàn)?36℃(7.7559，7.7709，7.7536)＞26℃(5.6839，5.7218，5.7076)＞ 4℃ (4.0969，4.0453，4.0492)。

LM在營(yíng)養(yǎng)肉湯中生長(zhǎng)的生長(zhǎng)曲線于PMP軟件進(jìn)行比較，MPD較低，但總體趨勢(shì)相同。初始濃度為103cfu/mL的LM生長(zhǎng)參數(shù)的實(shí)測(cè)值和PMP預(yù)測(cè)值的比較見(jiàn)表3?？梢钥闯?，U和LPD的實(shí)測(cè)值和預(yù)測(cè)值趨勢(shì)相同，都是隨著溫度的升高，U增快，LPD縮短。MPD的實(shí)測(cè)值和預(yù)測(cè)值差別較大，可能原因是實(shí)驗(yàn)選擇菌株的不同和單一造成的，該菌株可能受溫度影響較大，所以MPD達(dá)不到預(yù)測(cè)值，且隨著溫度降低，MPD減小。

表2 不同濃度LM菌懸液的Gompertz模型在不同溫度下的生長(zhǎng)參數(shù)Table 2 Gompertz model parameters of the growth of L.monocytogenes under different temperatures and concentrations

表3 LM生長(zhǎng)參數(shù)的實(shí)測(cè)值和PMP預(yù)測(cè)值的比較(初始濃度為103cfu/mL)Table 3 Comparison of observation and PMP predictive values on L.monocytogenes growth parameters

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)利用Matlab豐富的函數(shù)資源，成功擬合出不同溫度和不同LM濃度在營(yíng)養(yǎng)肉湯中的生長(zhǎng)初級(jí)模型。微生物生長(zhǎng)的初級(jí)模型一般通過(guò)S形曲線描述，主要模型有:Gompertz模型、Logistic模型、Richards 模型和 Baranyi模型等［9－10］。多數(shù)微生物生長(zhǎng)預(yù)測(cè)模型研究表明，Gompertz模型能很好描述微生物的生長(zhǎng)，Zhou［11］擬合了熱殺索絲菌(Brochothrix thermosphacta)的生長(zhǎng)曲線，發(fā)現(xiàn)Gompertz模型最合適，其次是Baranyi模型，最后是Logistic模型。本文分別擬合了Gompertz模型和Logistic模型，比較相關(guān)系數(shù)發(fā)現(xiàn)，Gompertz模型的R2均在0.98以上，所以認(rèn)為Gompertz模型能更好的擬合本實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)。

基于前人的研究，本實(shí)驗(yàn)選擇了三個(gè)不同溫度，36℃為L(zhǎng)M最適生長(zhǎng)溫度，26℃為室溫，4℃為食品冷藏溫度，研究結(jié)果具有指導(dǎo)意義。三個(gè)溫度下LM的生長(zhǎng)曲線與PMP預(yù)測(cè)軟件比較發(fā)現(xiàn)，實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值存在一定差別，但總體趨勢(shì)相同。

近年來(lái)，較多研究都致力于建立不同溫度下LM的生長(zhǎng)預(yù)測(cè)模型，如鄭麗敏［12］等建立了不同溫度下即食涼拌菜中單增李斯特菌的生長(zhǎng)模型，而很少有研究初始菌濃度對(duì)LM生長(zhǎng)的影響。本實(shí)驗(yàn)基于目前生長(zhǎng)預(yù)測(cè)模型研究的基礎(chǔ)，建立了不同初始濃度在不同溫度下LM在營(yíng)養(yǎng)肉湯中生長(zhǎng)的初級(jí)模型，明晰了LM增殖規(guī)律，為進(jìn)一步研究鮮活農(nóng)產(chǎn)品物流過(guò)程中LM的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)，研發(fā)綜合防控技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。

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