張大帥，王 燕，陳光英，王 菁，劉莉莉，唐 娟，尚清清，趙王丹，陳文豪

(海南師范大學(xué)“省部共建－熱帶藥用植物化學(xué)”教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，化學(xué)與化工學(xué)院，海南海口571158)

鐵欏(Amoora tsangii(Merr.)X.M.Chen)為楝科崖摩屬(Amoora)植物，產(chǎn)自海南，其地上部位在民間作為蠕蟲藥使用［1］。有研究報(bào)道從鐵欏枝葉中得到了7個(gè)新檸檬苦素類似物amotsangins A－G(1－7)，2個(gè)已知檸檬苦素類似物和4個(gè)已知倍半萜類化合物［2］，但并未見有關(guān)生物活性的研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)利用水蒸氣蒸餾法提取鐵欏葉揮發(fā)油，采用GC－MS聯(lián)用技術(shù)分析其的化學(xué)成分;并采用紙片瓊脂擴(kuò)散法和MTT比色法分別研究其抗菌、抗腫瘤活性。本文首次對(duì)鐵欏葉的揮發(fā)油的化學(xué)成分和抗菌及抗腫瘤活性進(jìn)行了研究，為研究鐵欏葉的藥用價(jià)值提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鐵欏葉 2012年9月采自海南三亞，經(jīng)海南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院鐘瓊芯教授鑒定為鐵欏葉，其標(biāo)本保存于海南師范大學(xué)熱帶藥用植物化學(xué)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;供試菌種:金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus Rosenbach)、大腸桿菌(Escherichia coli)、枯草桿菌(Bacillus subtilis);肺腺癌細(xì)胞SPCA－1 南方醫(yī)科大學(xué);肝癌細(xì)胞 BEL－7402 中國(guó)科學(xué)院上海藥物所;胃癌細(xì)胞 SGC－7901、白血病細(xì)胞K562 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院;RPMI1640培養(yǎng)液、胰酶 Gibco公司;MTT Sigma公司;其它試劑 均為市售分析純?cè)噭?/p>

7890A/5975C－GC/MSD氣質(zhì)聯(lián)用儀 Agilent公司;Elx800酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀 BioTek公司;倒置顯微鏡 重慶光學(xué)儀器廠;MCO－15AC CO2恒溫培養(yǎng)箱 SANYO公司;冷凍干燥機(jī) 北京四環(huán)科學(xué)儀器廠;電子天平 Sartious公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)條件

［3］的方法。GC條件:石英毛細(xì)管柱HP－FFAP(30m ×0.25mm，0.25μm)，程序升溫，起始溫度50℃，保持1min，以5℃/min升溫速率，升溫到230℃保持5min，再以8℃/min升溫速率，升溫到280℃，然后保持至完成分析，載氣為He(99.99%)，柱流量1.0mL/min，壓力28.8kPa，進(jìn)樣口溫度250℃，分流比 50∶1。

MS條件:EI源，電子能量為70eV，接口溫度為280℃，離子源溫度為230℃，四級(jí)桿溫度為180℃，溶劑延遲為2.5min，全掃描(Scan)采集模式，質(zhì)量范圍m/z 50～550u，掃描間隔0.50s，倍增器電壓1200V。

1.3 揮發(fā)油的提取

新鮮鐵欏葉總重600g，剪碎，分2次用水蒸氣蒸餾法提取8h，再用無水乙醚萃取，萃取液加無水硫酸鎂干燥，水浴蒸餾回收乙醚，最后得淡黃色油狀物，具有濃郁的芳香味，重量為2.525g，得油率為0.42%。

1.4 體外抗菌實(shí)驗(yàn)

將鐵欏葉揮發(fā)油配制多個(gè)濃度梯度，置冰箱(4℃)。用接種環(huán)從斜面上劃取一環(huán)菌苔，溶于10mL的無菌水中，得菌懸液。將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，用移液器取0.2mL菌懸液注入平板涂布均勻，在已接種的平板上放入浸泡在不同濃度樣品的濾紙片，用溶劑的濾紙片作為對(duì)照，以上操作均在無菌條件下進(jìn)行。培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果。用游標(biāo)卡尺采用十字交叉法測(cè)量其抑菌圈大小，然后取平均值，由抑菌圈大小比較說明抑菌作用的強(qiáng)弱［4］。

1.5 體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)

收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，配制細(xì)胞懸液，調(diào)整其細(xì)胞密度為10000個(gè)/mL，于96孔板中鋪板。培養(yǎng)8～12h后。加入濃度梯度的揮發(fā)油(1、10、100μg/mL三個(gè)濃度)20μL，培養(yǎng)44h。加入MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4h。吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)，加入 DMSO，振蕩10min，顯出藍(lán)紫色。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上選擇570nm，用空白孔調(diào)零，測(cè)定各孔的吸光值，記錄結(jié)果，計(jì)算抑制率。以濃度的對(duì)數(shù)值作橫坐標(biāo)，以抑制率作縱坐標(biāo)，作回歸曲線，計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 鐵欏葉揮發(fā)油分析

采用GC－MS分析鐵欏葉揮發(fā)油的化學(xué)成分，應(yīng)用面積歸一化法分析其總離子流圖(圖1)得出各成分百分含量，將總離子流圖通過譜數(shù)據(jù)庫(kù)檢索和文獻(xiàn)資料核對(duì)，確定了其中的52個(gè)成分，結(jié)果見表1。鐵欏葉揮發(fā)油的化學(xué)成分主要以倍半萜類化合物(79.15%)，(倍半萜烯化合物(59.94%)和氧化的倍半萜烯(19.21%)、醇類(5.59%)和酯類(5.17%)為主，其中含量較高的成分有石竹烯(20.58%)，(1S－順式)－1，2，4A，5，6，8A－六氫化－4，7－二甲基－1－(甲基乙基)－萘(8.16%)，tau.－muurolol(7.32%)，橙花叔醇(6.82%)等。

圖1 鐵欏葉揮發(fā)油的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of the essential oil from the leaves of A.tsangii

2.2 鐵欏葉揮發(fā)油體外抗菌結(jié)果

測(cè)定結(jié)果見表2。鐵欏葉揮發(fā)油對(duì)供試菌種均有不同程度的抑制作用，且隨揮發(fā)油劑量增加而增強(qiáng)。

表1 鐵羅葉揮發(fā)油的化學(xué)成分Table 1 Chemical constituents of essential oil from the leaves of A.tsangii

續(xù)表

續(xù)表

表2 鐵欏葉揮發(fā)油抑菌活性表Table 2 Antimicrobial activity of essential oil from the leaves of A.tsangii

2.3 鐵欏葉揮發(fā)油抗腫瘤結(jié)果

測(cè)定結(jié)果見表3。鐵欏葉揮發(fā)油對(duì)四種細(xì)胞均有一定的抑制活性;對(duì)SPCA－1和BEL－7402的抑制率大于50%。測(cè)試對(duì)這兩種癌細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度IC50。結(jié)果表明，其對(duì)SPCA－1的抑制活性最強(qiáng)，IC50值為11.2μg/mL;對(duì) BEL－7402 的 IC50值為35.52μg/mL。

表3 鐵欏葉揮發(fā)油對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的IC50值Table 3 The antitumor activity with IC50values of essential oil from the leaves of A.tsangii

3 結(jié)論

文獻(xiàn)報(bào)道，Chiang［6］等通過 GC/MS分析鐵欏同屬植物A.rohituka葉和果實(shí)的揮發(fā)油，發(fā)現(xiàn)其葉和果均富含倍半萜類化合物，葉和果的含量分別為90.4%和87%。同時(shí)發(fā)現(xiàn)兩部位的揮發(fā)油均表現(xiàn)出顯著的抗菌活性。本研究發(fā)現(xiàn)鐵欏葉的揮發(fā)油中同樣是倍半萜類化合物含量較高(79.15%)。其中石竹烯(20.58%)的含量最高，該類化合物具有局部麻醉作用和治療結(jié)腸炎作用［7］;同時(shí)可以和空氣中的微粒形成容易被植物吸收的顆粒，起到凈化空氣的作用［8］;研究發(fā)現(xiàn)β－石竹烯對(duì)小鼠口服給藥，能夠保護(hù)胃黏膜不受乙醇強(qiáng)酸等致炎因子的損傷，同時(shí)不影響胃酸的分泌，而表現(xiàn)出很好的抗?jié)兒涂寡鬃饔茫?］;從番荔枝樹皮的石油醚提取物中提取到的石竹烯氧化物具有很好的鎮(zhèn)痛和抗炎作用［10］。鐵欏葉的揮發(fā)油中石竹烯(20.58%)的含量最高，推導(dǎo)其應(yīng)有一定的抗菌活性?？咕鷮?shí)驗(yàn)表明，鐵欏葉揮發(fā)油對(duì)供試菌種(金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草桿菌)均表現(xiàn)出不同程度的抑制作用，且呈量效關(guān)系;另外，鐵欏葉揮發(fā)油對(duì)四種癌細(xì)胞(SPCA－1、BEL－7402、SGC－7901、K562)均有一定的增殖抑制活性，其中對(duì)SPCA－1 的抑制活性最強(qiáng)，IC50值達(dá)11.2μg/mL。

參考文獻(xiàn)

［1］中國(guó)科學(xué)中國(guó)植物志編輯委員會(huì).中國(guó)植物志［M］.北京:科學(xué)出版社，2010:80－83.

［2］Chen H D，Yang S P.Limonoids and Sesquiterpenoids from Amoora tsangii［J］.J Nat Prod，2008，71(1):93－97.

［3］張大帥，鐘瓊芯，宋鑫明，等.簕欓花椒揮發(fā)油的GC－MS分析及抗菌抗腫瘤活性研究［J］.中藥材，2012，35(8):1263－1267.

［4］Mehmet U，Emel E，Gulhan V，et al.composition，antimicrobial activity and in vitro cytotoxicity of essential oil from Cinnamomum zeylanicum Blume［J］.Food Bioprod Process，2010，48(11):3274－3280.

［5］Mosmann T.Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:application to proliferation and cytotoxicity assays［J］.J Immunol Methods，1983，65(1－2):55－63.

［6］Chiang L C，Chiang W，Chang M Y，et al.Antileukemic aetivity of Selected natural products products in Taiwan［J］.Am J Chin Med，2003，31(l):37－46.

［7］El－Sakhawy E A，F(xiàn)athy F S，Megid M M，et al.Composition and antimicrobial activity of the leaf and fruit oils from Amoora rohituka Wigth.et Arn［J］.J Essent Oil Res，2000，12(5):635－638.

［8］陳旭冰，仝誠(chéng)，陳光勇.β－石竹烯的研究進(jìn)展［J］.山東化工，2011，40(7):34－36.

［9］Tambe Y，Tsujiuchi H，Honda G，et al.Gastric cytoprotection ofthe non － steroidalanti－ inflammatory sesquiterpene，β－caryophyllene［J］.Planta Med，1996，62(5):469－470.

［10］Chavan M J，Wakte P S，Shinde D B.Analgesic and antiinflammatory activity ofcaryophyllene oxide from Auuoua squamosa L.bark［J］.Phytomedicine，2010，17(2):149－151.