李超英， 黃先愷， 楊光參， 王艷偉

(1．上饒師范學(xué)院物理與電子信息學(xué)院，江西上饒334001;2．溫州大學(xué)物理與電子信息工程學(xué)院，浙江溫州325035)

0 引言

DNA與蛋白質(zhì)分子的相互作用在許多生物過程中起著非常重要的作用，如DNA修復(fù)、復(fù)制與轉(zhuǎn)錄等［1-3］。DNA與蛋白相結(jié)合的精確位點(diǎn)的測(cè)定與觀察對(duì)于研究復(fù)雜細(xì)胞體系的機(jī)理與功能，特別是研究基因表達(dá)的控制十分關(guān)鍵［4-6］。限制性核酸內(nèi)切酶根據(jù)酶的亞單位組成、識(shí)別序列的種類和是否需要輔助因子至少可分為四類。Ⅱ 型限制與修飾系統(tǒng)所占的比例最大，達(dá)93%。限制性內(nèi)切酶在一定條件下能識(shí)別并切割特異的雙鏈DNA序列，但實(shí)際上內(nèi)切酶與DNA的作用方式很多，這與內(nèi)切酶、DNA的種類及緩沖液的條件等有一定關(guān)系。大多數(shù)內(nèi)切酶與DNA的相互作用都需要二價(jià)鎂離子作為催化輔助因子。在鎂離子存在下，內(nèi)切酶具有很大的切割活性，內(nèi)切酶會(huì)識(shí)別4～8堿基對(duì)的特異的序列，然后會(huì)在該識(shí)別位點(diǎn)上或附近切割DNA［7-9］。在錳離子存在的條件，內(nèi)切酶具有很小的切割活性;但在鈣離子存在的情況，內(nèi)切酶沒有活性。原因是鈣離子可以模仿鎂離子產(chǎn)生特異性蛋白-金屬-DNA復(fù)合物，這種穩(wěn)定的三元復(fù)合物阻礙內(nèi)切酶對(duì)DNA的切割活性，反而增加結(jié)合性［10-11］。如EcoRV是一種小的內(nèi)切酶，通過二聚體的形式與DNA發(fā)生作用，其識(shí)別序列是5’-GATATC-3’［12］。IIS 型內(nèi)切酶BspMI識(shí)別不對(duì)稱的序列5’-ACCTGC-3，然后在該位點(diǎn)旁邊上下的第4與第8個(gè)堿基對(duì)處切割［13］。在溶液中，這種內(nèi)切酶以四聚體形式存在，含有相同的子單元［14］。BspMI對(duì)DNA的切割一般先結(jié)合2個(gè)識(shí)別位點(diǎn)導(dǎo)致4個(gè)磷酸二脂鍵的斷裂，然后再與DNA分離，這與切割一個(gè)位點(diǎn)的內(nèi)切酶不同［15］，所以，如果緩沖液中鈣離子代替鎂離子時(shí)，這種內(nèi)切酶與DNA的結(jié)合會(huì)出現(xiàn)環(huán)狀結(jié)構(gòu)［16］。

原子力顯微鏡(AFM)作為一種高度分辨率可達(dá)0．1 nm左右，寬度分辨率可達(dá)2 nm左右的表面分析儀器，已廣泛地使用于觀察各種DNA與蛋白質(zhì)的相互作用，是研究這種作用最直接方便的操作方式［17-18］。本文用AFM研究?jī)?nèi)切酶EcoRV、BspMI與 λ-DNA的結(jié)合，內(nèi)切酶EcoRV與λ-DNA有21個(gè)識(shí)別位點(diǎn)，內(nèi)切酶BspMI與λ-DNA有41個(gè)識(shí)別位點(diǎn)，除了此結(jié)合位點(diǎn)外，也會(huì)有一些非特異性結(jié)合。由于作用方式的不同，結(jié)合的最終 AFM圖像明顯不同。本文主要用AFM對(duì)其不同作用方式的內(nèi)切酶與DNA的結(jié)合給出直接的證據(jù)，說明其彎曲效果與成環(huán)結(jié)構(gòu)。

1 AFM實(shí)驗(yàn)原理

在AFM系統(tǒng)中，使用微小懸臂來(lái)感測(cè)針尖與樣品之間的相互作用，該作用力會(huì)使微懸臂擺動(dòng)，當(dāng)擺動(dòng)發(fā)生時(shí)，會(huì)使照在懸臂末端的激光的反射光位置改變而造成偏移量，此時(shí)四象限激光檢測(cè)器會(huì)記錄此偏移量;然后把此時(shí)的信號(hào)傳給反饋系統(tǒng)，以利于系統(tǒng)做適當(dāng)?shù)恼{(diào)整;最后再將樣品的表面特性以影像的方式呈現(xiàn)出來(lái)。

AFM與樣品間的相互作用以范德華力為主，其作用勢(shì)能一般用Lennard-Jones勢(shì)能函數(shù)表示:

式中:r是勢(shì)能為0時(shí)兩原子的核間距;ε是勢(shì)阱深度，是勢(shì)能曲線上最低點(diǎn)勢(shì)能的絕對(duì)值。當(dāng)懸臂尖端的原子與樣品靠近，開始時(shí)吸引力起主導(dǎo)作用;隨著距離的減小，兩者之間的吸引力與排斥力將趨于平衡。當(dāng)兩原子進(jìn)一步靠近時(shí)，范德華力以斥力為主。

AFM的工作模式主要有:①“恒力”模式，是使用最廣泛的掃描方式，針尖與樣品間的作用力與距離有強(qiáng)烈的依賴關(guān)系，所以在掃描過程中利用反饋回路保持針尖與樣品之間的作用力恒定，即保持微懸臂的形變量不變，針尖就會(huì)隨樣品表面的起伏上下移動(dòng)，記錄針尖上下運(yùn)動(dòng)的軌跡即可得到樣品表面形貌的信息，完成樣品掃描任務(wù)。②“恒高”模式，即在X，Y掃描過程中，不使用反饋回路，保持針尖與樣品之間的距離恒定，通過測(cè)量微懸臂Z方向的形變量來(lái)成像。這種方式通常在觀察原子、分子像時(shí)用得比較多，可以采用很高的速度，但對(duì)于表面起伏比較大的樣品不適用。

2 材料與方法

2．1 材 料

噬菌體λ-DNA(NEB公司)，用前不需要進(jìn)一步純化。λ-DNA的原始濃度500 ng/μL，儲(chǔ)存液1×TE緩沖液(10 mmol/L Tris-HCl與 1 mmol/L EDTA，pH 8．0)。限制性內(nèi)切酶 EcoRV與 BspMI(Sigma-Aldrich公司)，其原始濃度是5 u/μL。分析純氯化鈣及其他的化學(xué)藥品(北京經(jīng)科宏達(dá)公司)。實(shí)驗(yàn)中用水都是超純水，經(jīng)過密理博超純水系統(tǒng)過濾、去離子化處理。云母做成1 cm×1 cm的正方形，每次用前用透明膠新解離后使用，以保證云母片表面的平整度與清潔。

2．2 AFM 成像

AFM(日本京都島津公司，型號(hào)為SPM-9600)。所有的圖像都是在空氣中采用輕敲模式獲得。掃描速度3 Hz，均方振幅2 V，驅(qū)動(dòng)頻率約350 kHz，硅探針具有固定的彈性系數(shù)42 N/m。圖片512×512像素。在AFM圖像中DNA高度、寬度等信息出SPM-9600自帶的離線分析軟件獲得。

2．3 AFM樣品準(zhǔn)備

λ-DNA(500 ng/μL)的貯存液用含有10 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L NaCl和 10 mmol/L CaCl2的緩沖液稀釋。DNA的最終濃度是1．25 ng/μL。接著把不同單位濃度的內(nèi)切酶與DNA溶液混合，然后把混合液放到37℃的干式恒溫器內(nèi)放置30 min，用移液器取出15μL的混合液放到剛解離的云母片上面，沉積2min后，每次用20μL的Milli-Q超純水沖洗云母片，約沖洗10～15次，目的是去除云母表面多余的DNA分子，最后立即用氮?dú)獯蹈纱谩?/p>

3 結(jié)果與討論

本文用AFM研究了II型限制性內(nèi)切酶EcoRV與λ-DNA的相互作用。一般情況下，內(nèi)切酶對(duì)DNA有切割作用，但是用鎂離子代替緩沖液中的鈣離子后，內(nèi)切酶的切割作用會(huì)被阻止。此時(shí)這種內(nèi)切酶以二聚體形式綁定DNA的序列5’-GATATC-3’，會(huì)形成一個(gè)一個(gè)珠串狀結(jié)構(gòu)，如圖1所示。在λ-DNA分子上面，這種序列出現(xiàn)過21次，隨著內(nèi)切酶濃度的增加，DNA上面結(jié)合位點(diǎn)數(shù)也不斷增加，因此，如果每個(gè)位點(diǎn)都結(jié)合上內(nèi)切酶的話，一根DNA上面應(yīng)該有21個(gè)點(diǎn)。但是由圖2知，當(dāng)內(nèi)切酶濃度達(dá)到5 u/mL時(shí)，單根DNA上面結(jié)合位點(diǎn)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示不止有21個(gè)，可見在特異性結(jié)合的同時(shí)，也有一些非特異性結(jié)合。而且在圖1(C)黑色圓圈中明顯看出DNA上面內(nèi)切酶結(jié)合的地方，DNA會(huì)發(fā)生彎曲，說明EcoRV對(duì)DNA還有扭轉(zhuǎn)彎曲的作用。

圖1 EcoRV與DNA相互作用的AFM圖像

圖3 是IIs型限制性內(nèi)切酶BspMI與DNA的相互作用的AFM圖像，用鈣離子代替緩沖液中的鎂離子后，內(nèi)切酶對(duì)DNA沒有切割作用，這種內(nèi)切酶會(huì)以四聚體形式結(jié)合到DNA的單個(gè)序列5’-GAATTC-3’或綁定2個(gè)DNA的序列形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。在λ-DNA分子上面，這種序列出現(xiàn)過41次。在實(shí)驗(yàn)過程中，發(fā)現(xiàn)有些蛋白并沒有綁定2個(gè)DNA序列而形成環(huán)，而是會(huì)綁定到DNA的一個(gè)識(shí)別位點(diǎn)，如圖3(D)黑色圓圈所示。改變內(nèi)切酶濃度，在云母片上面觀察BspMI-DNA的復(fù)合物，在圖3中可以看到，綁定單個(gè)位點(diǎn)或2個(gè)位點(diǎn)而形成環(huán)的兩種情況。當(dāng)內(nèi)切酶BspMI的濃度很高時(shí)，就會(huì)有更多的環(huán)狀形成。圖4為DNA上面內(nèi)切酶的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)量統(tǒng)計(jì)圖，隨著內(nèi)切酶濃度的增加，綁定單個(gè)位點(diǎn)及2個(gè)位點(diǎn)形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)的數(shù)量都在增加，統(tǒng)計(jì)時(shí)把成環(huán)結(jié)構(gòu)看成2個(gè)位點(diǎn)綁定進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。由圖4可知，內(nèi)切酶濃度達(dá)到5 u/mL時(shí)，DNA上面的環(huán)狀結(jié)構(gòu)很多，而且對(duì)單根DNA上面內(nèi)切酶的結(jié)合數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)也不止41個(gè)，說明也有非特異性的結(jié)合，而且發(fā)現(xiàn)內(nèi)切酶的體積變大，可能發(fā)生內(nèi)切酶之間的聚集。

圖2 EcoRV與DNA相互作用結(jié)合位點(diǎn)的統(tǒng)計(jì)圖

圖3 BspMI-DNA復(fù)合物的AFM圖像

圖4 BspMI與DNA相互作用結(jié)合位點(diǎn)的統(tǒng)計(jì)圖

圖5 是兩種內(nèi)切酶與DNA作用的模型圖，能夠更直觀形象地說明其相互作用。在鈣離子緩沖液中，兩種內(nèi)切酶與DNA結(jié)合作用是不同的。限制性內(nèi)切酶EcoRV是二聚體的結(jié)構(gòu)，與DNA的單個(gè)位點(diǎn)結(jié)合，并使DNA發(fā)生彎曲，形成珠串狀結(jié)構(gòu)，如圖5(A)所示。BspMI是四聚體的結(jié)構(gòu)，四聚體有2個(gè)識(shí)別位點(diǎn)，BspMI與DNA結(jié)合作用或結(jié)合一個(gè)位點(diǎn)形成珠串狀結(jié)構(gòu)，或結(jié)合2個(gè)位點(diǎn)形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，如圖5(B)所示。

圖5 兩種內(nèi)切酶與DNA作用的模型圖

4 結(jié)語(yǔ)

本文利用AFM研究λ-DNA與內(nèi)切酶蛋白的相互作用，主要對(duì)兩種內(nèi)切酶與DNA的成像進(jìn)行對(duì)比。該方法不僅可用于科學(xué)研究，還可引入近代物理實(shí)驗(yàn)教學(xué)。該實(shí)驗(yàn)的開設(shè)不僅可提高學(xué)生的動(dòng)手操作能力，而且對(duì)生物學(xué)中重要的過程如DNA與內(nèi)切酶的作用進(jìn)行直接觀察，拓寬學(xué)生們對(duì)生物學(xué)與物理學(xué)結(jié)合領(lǐng)域的認(rèn)識(shí)。

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