張曉申，高 進(jìn)，鄭文博，葉熹罡，唐 煒，陳 倫，潘凌霄，李 君

(廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院乳腺外科1、肝膽外科2，廣東 廣州 510120)

趨化因子配體18(Chemokine CC-motif ligand 18，CCL18)屬CC族趨化因子，主要由M2型單核細(xì)胞分泌[1]。CCL18參與各種慢性炎癥和纖維化疾病的發(fā)生發(fā)展，包括Gancher病和類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎[2-3]。另外，在卵巢癌、胃癌組織中可觀察到CCL18的表達(dá)[4-5]。然而，CCL18在惡性腫瘤進(jìn)展中的作用還存在爭(zhēng)議。CCL18參與卵巢癌的免疫抑制[5-6]，而在胃癌患者中，CCL18卻起著局部抗腫瘤免疫調(diào)節(jié)的作用[4]。雖然M2型巨噬細(xì)胞大量存在于乳腺癌組織中，但由其產(chǎn)生的CCL18因子在乳腺癌進(jìn)展中的作用仍不清楚。本研究通過(guò)檢測(cè)乳腺癌組織、良性乳腺病組織和正常乳腺組織CCL18的表達(dá)情況，并分析其與乳腺癌患者的臨床病理特征的關(guān)系，如腫瘤大小、分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Ki67，探討CCL18在乳腺癌組織的表達(dá)意義。

1 材料與方法

1.1 一般資料 選取廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院乳腺外科2009年12月至2012年6月，病理診斷為乳腺癌的患者80例(包括導(dǎo)管原位癌8例，浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌72例)，年齡35～68歲，中位年齡41歲；選取病理診斷為良性乳腺病患者40例(包括：乳腺纖維腺瘤16例，導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤7例，纖維囊性乳腺病17例)，年齡31～46歲，中位年齡38歲。再取20例良性乳腺病患者病灶周邊的正常乳腺組織作為對(duì)照組。全部入組病例為女性。

1.2 主要試劑 免疫組化試劑盒EnVisionTMDetection Kit(DAKO公司，美國(guó))、CCL18抗體為兔抗人多抗(Abcam公司，英國(guó))，鼠抗人Ki67單抗免疫組人試劑盒(上海麥莎生物科技有限公司)。

1.3 免疫組化EnVision法檢測(cè) 將制作好的病理切片于67℃烤箱烤片1 h后脫蠟至水。CCL18、Ki67切片采用微波(15 min)修復(fù)抗原。CCL18的抗體稀釋濃度為1：200。后續(xù)步驟按EnVisionTMDetection Kit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。Ki67切片用SP法進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 結(jié)果判定 CCL18判定標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)Chen等[7]的報(bào)道方法，以顯微鏡下棕黃色胞漿染色細(xì)胞為陽(yáng)性反應(yīng)，計(jì)數(shù)全視野內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。Ki67陽(yáng)性細(xì)胞為胞核著色，取任意5個(gè)高倍鏡視野，以陽(yáng)性細(xì)胞所占細(xì)胞總數(shù)的平均值作為Ki67陽(yáng)性率，參考Aleskandarany等[8]的研究將其分為3個(gè)等級(jí)：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜10%為弱陽(yáng)性(+)，10%～50%為陽(yáng)性(++)，＞50%為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。均由兩位病理科醫(yī)師獨(dú)立閱片，當(dāng)結(jié)果不同時(shí)，取平均值為最終結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，分類(lèi)計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組中CCL18的表達(dá) CCL18在對(duì)照組、良性乳腺病組均無(wú)表達(dá)，在乳腺癌組有57例為陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性率為71.25%；CCL18在乳腺癌組的表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=72.108，P＜0.001)，見(jiàn)表1。

表1 三組中CCL18的表達(dá)(例)

2.2 乳腺癌組CCL18的表達(dá)及其與腫瘤大小、分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Ki67的關(guān)系 CCL18的表達(dá)與腫瘤的大小、病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移個(gè)數(shù)呈正相關(guān)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而與Ki67的表達(dá)相關(guān)性不顯著，見(jiàn)表2。

表2 CCL18在乳腺癌組的表達(dá)與腫瘤大小、分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Ki67的關(guān)系(例)

3 討論

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，主要死亡原因是術(shù)后復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移，其發(fā)生發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的有多種生物學(xué)指標(biāo)參與的過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌的侵襲性與腫瘤微環(huán)境密切相關(guān)，而腫瘤微血管、炎癥細(xì)胞、趨化因子是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分[9-12]。趨化因子是由不同類(lèi)型細(xì)胞分泌的能使細(xì)胞發(fā)生趨化運(yùn)動(dòng)的低分子能量細(xì)胞因子，具有廣泛的生物學(xué)作用。除了在炎癥過(guò)程中可特異性激活和募集白細(xì)胞外，還可通過(guò)改變腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為和激活腫瘤微環(huán)境中基質(zhì)干細(xì)胞(如血管內(nèi)皮細(xì)胞、腫瘤相關(guān)巨噬和成纖維細(xì)胞)，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[13-15]。CCL18基因定位于染色體17q11.2，不僅參與機(jī)體的免疫應(yīng)答，還在多種腫瘤的發(fā)生中扮演著重要的角色。Chen等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌組織中存在M2型單核細(xì)胞，位于腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)的前沿組織，且表達(dá)CCL18。而在本研究中，CCL18在乳腺癌組織中的表達(dá)比在良性乳腺疾病組織及正常乳腺組織中明顯升高，且與腫瘤的大小、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移成正比，表明CCL18有可能成為一種新的乳腺癌生物學(xué)指標(biāo)，并在一定程度上可以反映乳腺癌的侵襲性與轉(zhuǎn)移，與Chen等[7]觀察到的一致。

1983年Gerdes等[16]發(fā)現(xiàn)了Ki67與細(xì)胞增殖相關(guān)的核抗原。其表達(dá)隨細(xì)胞周期的變化而變化，能反映腫瘤的增殖活性，是公認(rèn)的細(xì)胞增殖活性標(biāo)志物。作為一種與增殖細(xì)胞相關(guān)的核抗原，Ki67抗原與惡性腫瘤的發(fā)展與轉(zhuǎn)移關(guān)系密切[17]，高表達(dá)時(shí)易出現(xiàn)乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[18]，且與乳腺癌臨床分期密切相關(guān)，其陽(yáng)性率隨臨床分期的遞增而增加明顯[19]。Narita等[20]研究發(fā)現(xiàn)CCL18在乳腺癌患者血漿中的濃度與Ki67的表達(dá)呈正相關(guān)，但Chen等研究[7]發(fā)現(xiàn)，CCL18在乳腺癌組織中的表達(dá)與Ki67的表達(dá)相關(guān)性不顯著。在本研究中，在乳腺癌組織CCL18的表達(dá)與Ki67的相關(guān)性不明顯，這表明CCL18與乳腺癌細(xì)胞的侵襲力相關(guān)，而與乳腺癌細(xì)胞的增殖活性無(wú)關(guān)。

綜上所述，CCL18可作為一種新的乳腺癌生物學(xué)指標(biāo)，其高表達(dá)表明乳腺癌侵襲性強(qiáng)，容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，但與腫瘤細(xì)胞的增殖活性無(wú)關(guān)，對(duì)判斷乳腺癌的預(yù)后有指導(dǎo)意義。

[1]Kodelja V,Muller C,Politz O,et al.Altemative macrophage activation-associated CC-chemokine-1,a novel structural homologue of macrophage inflammatory protein-1 alpha with a Th2-associated expression pattem[J].J Immunol,1998,160(3)：1411-1418.

[2]Martine FO,Helming L,Gordon S.Alternative activation of macrophages：an immunologic functional perspective[J].Annu Rev Immunol,2009,27：451-483.

[3]Schutyser E,Struf S,Proost P,et al.Identification of biologically active chemokine isoforms from ascitic fluid and elevated levels of CCL18/pulmonary and activation-regulated chemokine in ovarian carcinoma[J].J Biol Chem,2002,277(27)：24584-24593.

[4]Leung SY,Yuen ST,Chu KM,et al.Expression profiling iadentifies chemokine(C-C motif)ligand 18 as an independent prognostic indicator in gastric cancer[J].Gastroenterology,2004,127(2)：457-459.

[5]Zohny SF,Fayed ST.Clinical utility of circulating matrix metalloproteinase-7(MMP-7),CC chemokine ligand 18(CCL18)and CC chemokine ligand 11(CCL11)as markers for diagnosis of epithelial ovarian cancer[J].Med Oncol,2010,27(4)：1249-1253.

[6]Duluc D,Corvaisier M,Blanchard S,et al.Interferon-gamma reverses the immunosuppressive and protumoral properties and prevents the generation of human tumor-associated macrophages[J].Int J Cancer,2009,125(2)：367-373.

[7]Chen J,Yao Y,Gong C,et al.CCL18 from tumor-associated macrophages promotes breast cancer metastasis via PITPNM3[J].Cancer Cell,2011,19(4)：541-555.

[8]Aleskandarany MA,Green AR,Benhasouna AA,et al.Prognostic value of proliferation assay in the luminal,HER2 positive and triple negative biological classes of breast cancer[J].Breast Cancer Res,2012,14(1)：R3.

[9]Shao ZM,Nguyen M,Barsky SH.Human breast carcinoma desmoplasia in PDGF initiated.Oncogene[J].2000,19(38)：4337-4345.

[10]Kalluri R,Zeibsberg M.Fibrobasts in cancer[J].Nat Rev Cancer,2006,6(5)：392-401.

[11]Orimo A,Weinberg RA.Stromal fibroblasts in Cancer：a novel tumor-promoting cell type[J].Cell Cycle,2006,5(15)：1597-1601.

[12]Allinen M,Beroukhim R,Cai L,et al.Molecular characterization of the tumor microenvironment in breast cancer[J].Cancer Cell,2004,6(1)：17-32.

[13]Mantovani A,Allavena P,Sica A,et al.Cancer-related inflammation[J].Nature,2008,454(7203)：436-444.

[14]Coussens LM,Werb Z.Inflammation and cancer[J].Natuere,2002,420(6917)：860-857.

[15]Fidler IJ.The pathogenesis of cancer metastasis：the‘seed nad soil’hypothesis revisited[J].Nat Rev Cancer,2003,3(6)：453-458.

[16]Gerdes J,Schwab U,Lemke H,et al.Production of a mouse monoclonal antibody reactive with a human nuclear antigen associated with cell proliferation[J].Int J Cancer,1983,31(1)：13-20.

[17]Penault-Llorce F,Andre F,Sagan C,et al.Ki67 expression and docetaxel efficacy in patients with eatrogen receptor-positive breast cancer[J].J Clin Oncol,2009,27(17)：2809-2815.

[18]Rodger A.Who would have thought it!Influence on outcome of radiotherapy,Ki67 and stroma.Introduction to Session 5[J].Breast Cancer Res,2009,11(3)：S13.

[19]Santisteban M,Reynolds C,Barr Fritcher EG,et al.Ki67：a time-varying biomarker of risk of breast cancer in atypical hyperplasia[J].Breast Cancer Res Treast,2010,121(2)：431-437.

[20]Narita D,Seclaman E,Ursoniu S,et al.Expression of CCL18 and interleukin-6 in the plasma of breast cancer patients as compared with benign tumor patients and healthy controls[J].Rom J Morphol Embryol,2011,54(4)：1261-1267.