孫飛，王愛杰，嚴群，張光生

1 江南大學(xué)環(huán)境與土木工程學(xué)院，江蘇 無錫 2141222 哈爾濱工業(yè)大學(xué)市政與環(huán)境工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150090

生物電化學(xué)系統(tǒng)還原降解氯霉素

孫飛1，王愛杰2，嚴群1，張光生1

1 江南大學(xué)環(huán)境與土木工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122
2 哈爾濱工業(yè)大學(xué)市政與環(huán)境工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150090

孫飛, 王愛杰, 嚴群, 等. 生物電化學(xué)系統(tǒng)還原降解氯霉素. 生物工程學(xué)報, 2013, 29(2): 161?168.

Sun F, Wang AJ, Yan Q, et al. Reductive degradation of antibiotic chloramphenicol in bioelectrochemical system. Chin J Biotech, 2013, 29(2): 161?168.

為了探討低溫 (12±2 ℃) 條件下還原降解硝基芳香類抗生素氯霉素，采用序批式生物電化學(xué)系統(tǒng)(Bioelectrochemical system，BES) 陰極還原的方式 (外加0.5 V電壓)，主要研究氯霉素在BES生物陰極與非生物陰極中的不同降解速率、代謝途徑和氯霉素在電化學(xué)系統(tǒng)中被還原為胺類產(chǎn)物從而脫除細菌抗性。實驗數(shù)據(jù)表明，BES反應(yīng)器整體的歐姆內(nèi)阻隨著磷酸鹽緩沖液濃度的增加而減?。划?dāng)葡萄糖和污泥發(fā)酵液分別存在時，生物陰極24 h的氯霉素還原效率分別為 (86.3±1.69)%和 (74.1±1.44)%，而相同條件下的非生物陰極24 h氯霉素還原效率僅為 (57.9±1.94)%。研究結(jié)果表明，生物電化學(xué)系統(tǒng)還原降解氯霉素使其失去生物抗性是可行的，并且在低溫地區(qū)含氯霉素廢水的處理過程中，生物陰極是極具潛力的一項處理工藝。

生物電化學(xué)系統(tǒng)，生物陰極，氯霉素，歐姆內(nèi)阻，低溫

抗生素是一類環(huán)境新型污染物，在傳統(tǒng)廢水處理過程中很難被有效去除。污水處理廠未能去除的抗生素在環(huán)境中富集，將會導(dǎo)致含有抗生素耐藥基因的多種微生物的進化，從而影響人類健康[1-2]。氯霉素 (Chloramphenicol，CAP)，作為一種硝基芳香類廣譜抗生素，在20世紀50年代被廣泛應(yīng)用于治療人類和家禽的多種疾病。如今，在包括中國在內(nèi)的許多發(fā)展中國家，CAP在污水處理廠的出水、地表水和地下水中頻繁地被檢測出來，檢出濃度為0～1 050 ng/L不等[3]，高濃度氯霉素制藥廢水檢測濃度為150～300 mg/L[4]。因此，去除廢水中殘留的氯霉素微生物抗性，進而消除因抗性基因和抗性微生物進化引起的危機，是必要而緊迫的。

為了提高氯霉素去除效率，多種物理化學(xué)方法被用于含氯霉素廢水的處理，如光催化降解法[5]、Fenton法[6]、微波輻射法[7]、竹炭吸附法[8]等。然而，這些方法都存在著能源浪費或造成二次污染的缺點。因此，探索新型高效的氯霉素去除方法非常重要。與上文提及的傳統(tǒng)氯霉素去除方法相比，生物電化學(xué)系統(tǒng) (BES) 因其較高的去除效率、較低運行成本和環(huán)境可持續(xù)性等優(yōu)點而受到越來越多的關(guān)注[9-12]。傳統(tǒng)的厭氧轉(zhuǎn)化過程中，低溫會降低污染物的降解速率[13]，所以在中溫帶地區(qū)當(dāng)冬天溫度降至5～10 ℃時，探索高效穩(wěn)定的低溫條件下氯霉素的降解工藝尤為重要。而低溫條件下生物電化學(xué)降解氯霉素目前尚無研究。

本實驗研究了BES在低溫條件下 (12±2 ℃)提高CAP去除效率的影響參數(shù)：分別為不同磷酸鹽緩沖液體系 (PBS) 濃度條件下 BES反應(yīng)器的電化學(xué)特性，當(dāng)碳源 (外加電子供體) 分別為葡萄糖和污泥發(fā)酵液 (Sludge fermentation liquid，SFL) 時生物陰極CAP去除效率及其與非生物陰極的效果對比。

1 材料與方法

1.1 厭氧污泥、CAP和污泥發(fā)酵液

用于富集CAP降解微生物群落的污泥來自于太平污水處理廠 (哈爾濱，中國)。實驗所用CAP (純度≥98%) 購買于Sigma-Aldrich公司。SFL如文獻所述[14]經(jīng)過超聲處理，之后添加到雙極室電化學(xué)反應(yīng)器的陰極室作為碳源和外加電子供體。

1.2 反應(yīng)器結(jié)構(gòu)與組裝

實驗所用雙極室BES反應(yīng)器材料為聚碳酸酯。反應(yīng)器主體由兩塊大小相等的模塊 (7 cm×7 cm×4 cm) 組裝而成，模塊中空呈圓柱形的腔(直徑5 cm，長4 cm)。模塊用螺栓連接，中間用陽離子交換膜 (Ultrex CMI-7000，膜國際，美國) 分隔，左右各用一塊聚碳酸酯平板 (7 cm×7 cm×1 cm) 密封。單個極室體積為85 mL。陽極為碳刷 (直徑4 cm，長3 cm，東邦，日本)，陰極為碳布 (直徑5 cm，非耐濕，YB-20，億邦科技，中國)。鈦絲 (直徑 1 mm，寶雞力興鈦業(yè)) 被壓平緊貼于碳布用于收集電子。飽和甘汞參比電極 (SCE，0.247 V vs. SHE，217型，上海精密科學(xué)儀器，中國) 嵌入陰極室用于測量陰極電勢。

1.3 反應(yīng)器運行

反應(yīng)器陽極與陰極微生物富集方法如文獻所述[15]，陽極馴化成功的標(biāo)志為電位穩(wěn)定在-0.4 V左右，所有富集和實驗過程都在低溫條件下運行 (12±2 ℃)，使用直流開關(guān)電源(HY-60 A) 外加0.5 V電壓。取污水處理廠污泥上層清液與陰極液按照 1∶3的體積比混合均勻，其中，陰極液含有30 mg/L CAP、500 mg/L葡萄糖、礦質(zhì)元素和維他命濃縮液[14]，配制溶液所用蒸餾水先煮沸除氧，藥品溶解混勻之后再向溶液中曝氮氣15 min。

氯霉素的還原過程在兩種模式下進行：1) BES非生物陰極 (陰極液 PBS濃度分別為50 mmol/L、25 mmol/L和10 mmol/L)；2) BES生物陰極 (陰極液為25 mmol/L PBS，葡萄糖或SFL作為外加電子供體)。SFL添加量相當(dāng)于500 mg化學(xué)需氧量 (COD)。使用數(shù)據(jù)記錄儀(型號 2700，吉時利，美國) 記錄電壓電勢。電流 (I) 和氯霉素還原效率 (ErCAP，%) 按照前述方法計算[15]。CAP還原降解趨勢用指數(shù)衰減方程擬合 (SigmaPlot v.11.0)：

Ct為氯霉素濃度 (mg/L)；t為反應(yīng)時間 (h)；C0為氯霉素初始濃度，約30 mg/L；k(h-1) 為速率常數(shù)；y0為系統(tǒng)偏差；氯霉素半衰期t1/2使用如下方程計算t1/2=0.693/k。

1.4 分析方法

高效液相色譜 (HPLC)：氯霉素及其還原產(chǎn)物的濃度均用高效液相色譜 (型號 2695，Waters，美國) 檢測，色譜柱為C18(色譜柱長度250 mm，色譜柱內(nèi)徑4.6 mm，填料顆粒直徑5 μm)，檢測器為紫外檢測器，氯霉素檢測波長為275 nm，還原產(chǎn)物的檢測波長為250 nm和310 nm。流動相甲醇與水的比例為55∶45，流速0.8 mL/min，檢測溫度30 ℃。

高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用 (HPLC-MS/MS)：HPLC-MS/MS (賽默飛世爾離子色譜 Thermo Finnigan LCQ Deca XP Max LC/MS，德國) 用于氯霉素最終還原產(chǎn)物的鑒定。反應(yīng)器0 h和96 h的樣品先在轉(zhuǎn)速13 000×g下離心30 min，取上層清液用甲醇稀釋，然后進行檢測。

電化學(xué)交流阻抗譜 (EIS)：EIS是一項功能強大的技術(shù)，常用于研究反應(yīng)器結(jié)構(gòu)和電極材料對電化學(xué)反應(yīng)過程中電子傳遞阻力即反應(yīng)器內(nèi)阻的影響。因此，實驗用 EIS揭示不同磷酸鹽濃度 (50 mmol/L、25 mmol/L和10 mmol/L)和生物陰極對于反應(yīng)器內(nèi)阻的影響。實驗所用儀器為三電極系統(tǒng)的電化學(xué)工作站 (型號660D，華辰，美國)，頻率范圍105到10-2Hz，電壓0.5 mV，測量項目為非生物陰極、生物陰極和整個反應(yīng)器的歐姆內(nèi)阻和極化內(nèi)阻。EIS圖譜擬合軟件采用Zsimpwin 3.10。

2 結(jié)果與分析

2.1 磷酸鹽濃度對CAP還原效率的影響

氯霉素在不同 PBS濃度條件下降解速率常數(shù)k和半衰期t1/2如圖1所示。12 h和24 h條件下ErCAP和k都隨著PBS濃度的增加而增加，如表1所示，50 mmol/L，25 mmol/L和10 mmol/L PBS條件下在 24 h的 ErCAP和k分別為(59.62±2.75)%、(62.9±8.73)%、(63.24±1.95)%和0.0367±0.0013、0.0420±0.0013、0.0525±0.0020。結(jié)果表明，較高的PBS濃度可以促進電子的傳遞進而加速電化學(xué)反應(yīng)的發(fā)生[16]?？紤]到 BES在實際工程中運用的環(huán)境影響，在后續(xù)的研究中采用25 mmol/L PBS濃度作為電解液，因其具有較低的磷酸鹽投加量和中等的還原效率。

2.2 生物陰極還原降解CAP

圖 1和表1同時顯示了生物陰極的氯霉素還原速率，數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)生物陰極外加電子供體為葡萄糖和SFL時，氯霉素的降解速率常數(shù)k和氯霉素半衰期t1/2均與非生物陰極有較大差別，PBS濃度同為 25 mmol/L時，生物陰極k=0.0838±0.0051，t1/2=8.27 h，而非生物陰極k=0.0420±0.0013，t1/2=16.50 h。這說明了生物陰極強化了氯霉素還原作用，附著生長在陰極上的生物通過直接從電極獲得電子或者從外加電子供體獲得電子后，將電子用于還原氯霉素。同時可以看到，以SFL作為外加電子供體時，氯霉素的還原速率較葡萄糖作為外加電子供體低，其k=0.0596±0.0026，t1/2=11.63 h，原因可能是由于SFL中容易被微生物直接利用的乙酸含量較少，僅為41.50%，而微生物利用乙酸等短鏈脂肪酸產(chǎn)生H2對于陰極電化學(xué)反應(yīng)具有一定的促進作用[15,17]。上述結(jié)果表明，生物陰極強化了氯霉素的還原效率，并且，若選擇 SFL作為碳源和外加電子供體代替葡萄糖的添加不僅可以減少碳足跡，同時可以降低BES在規(guī)模擴大化之后的運行成本。這也預(yù)示著污泥發(fā)酵工藝耦合BES生物陰極降還原解抗生素類的微污染物將成為可能。

圖1 不同條件下氯霉素還原降解濃度變化Fig. 1 Cathodic reductive degradation of CAP under different conditions.

表1 不同模式下的ErCAP、k和t1/2值Table 1 ErCAP and k as well as t1/2 value under different mode

2.3 電化學(xué)交流阻抗譜

實驗運用 EIS技術(shù)探索了不同磷酸鹽濃度對BES反應(yīng)器整體歐姆內(nèi)阻的影響及非生物陰極與生物陰極歐姆內(nèi)阻的差異。如圖 2所示，圖中每一個實心圓點都代表了特定頻率下的阻抗值。起始位置是高頻區(qū)，代表反應(yīng)器的歐姆內(nèi)阻，而半圓形曲線的直徑則代表極化內(nèi)阻 (Rp) (或電荷傳遞阻力)[18]。由圖 2A可知，不同的磷酸鹽濃度影響B(tài)ES反應(yīng)器的歐姆內(nèi)阻和極化內(nèi)阻 (表2)，隨著磷酸鹽濃度的提高，反應(yīng)器的歐姆內(nèi)阻和極化內(nèi)阻同時減小，當(dāng)磷酸鹽濃度為 10 mmol/L、25 mmol/L和50 mmol/L時，反應(yīng)器的歐姆內(nèi)阻分別為 59.5 ?、87.77 ? 和 186.5 ?。由圖 2B 可知，生物陰極是另一種減小反應(yīng)器內(nèi)阻的方式，因為生物陰極的內(nèi)阻遠遠小于非生物陰極。這說明附著在陰極電極上的微生物可以降低電子在溶液與電極之間的傳遞阻力，甚至有的微生物直接從電極獲得電子用于底物的還原[19]。究其原因，微生物細胞膜既是細胞的保護膜，又是物質(zhì)傳遞的通道，它可以通過主動運輸?shù)确绞礁杆俚南虬鼉?nèi)傳遞離子，這可能是生物陰極減小內(nèi)阻的原因之一，更深入全面的研究還有待繼續(xù)進行。

圖2 不同磷酸鹽濃度條件的非生物陰極 (A，整個反應(yīng)器) 和生物陰極 (B，陰極) 的電化學(xué)交流阻抗譜Fig. 2 The impedance of the bioelectrochemical reactor in presence of different levels of PBS buffer (mmol/L) (A,whole cell) and in biocathode (B, cathode).

表2 不同磷酸鹽濃度條件下BES反應(yīng)器交流阻抗譜擬合值 (Rs：溶液內(nèi)阻，Rp：極化內(nèi)阻)Table 2 Fit parameters for spectra of the BES reactors at different PBS concentrations (Rs: solution resistance, Rp: polarization resistance)

圖3 氯霉素還原終產(chǎn)物液質(zhì)聯(lián)用的鑒定Fig. 3 HPLC-MS/MS identification of CAP reductive end product. (A) AM was not detected in the CAP control sample (0 h). (B, C) AM in biocathode and abiotic cathode effluent at 96 h. (D) AM had the chlorine atoms isotope characteristic and had m/z of 294, 296, and 298[M+H]+.

2.4 還原終產(chǎn)物

BES還原降解 CAP的終產(chǎn)物使用HPLC-MS/MS檢測分析，結(jié)果如圖3所示。其中，生物陰極樣品 3.50 min (圖 3B) 出峰物質(zhì)和非生物陰極3.37 min出峰物質(zhì) (圖3C) 初步鑒定為同一終產(chǎn)物。

Smith 等[20]和 Zhao 等[21]曾對氯霉素的生物還原過程進行研究，其結(jié)論顯示該終產(chǎn)物已缺失了細菌抗性。因此，BES還原降解氯霉素使之脫除生物抗性，對于后續(xù)代謝產(chǎn)物的生物降解以至生物礦化都具有重大意義。

3 結(jié) 論

研究了低溫條件下在BES反應(yīng)器中生物電化學(xué)還原降解氯霉素的效果。生物陰極相對于非生物陰極具有較快的CAP降解速率，同時，增加PBS濃度和附著生長在電極上的生物膜都可以降低反應(yīng)器的歐姆內(nèi)阻和極化內(nèi)阻，進而提高CAP的去除效率。另外，SFL可以用于生物陰極作為碳源和外加電子供體代替葡萄糖。綜上所述，研究表明功能生物陰極可以用于低溫地區(qū)還原降解含抗生素類微污染物的廢水處理過程。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

September 19, 2012; Accepted: December 18, 2012

Qun Yan. Tel/Fax: +86-510-85197872; E-mail: yanqun@jiangnan.edu.cn

江蘇省高?？蒲挟a(chǎn)業(yè)化項目 (No. JHB2011-29)，江蘇省自然科學(xué)經(jīng)費 (No. BK2012558) 資助。Abstract: In this study, we investigated reductive degradation of nitroaromatic antibiotic chloramphenicol to non-effective antibacterial amine product in fed-batch biocatalyzed electrolysis systems (BES) (applied voltage was 0.5 V)under low temperature (12±2 °C). The ohm resistance of the whole BES reactor increased when the phosphate buffer solution concentrations decreased. Efficiencies (ErCAP) of chloramphenicol reduction with biocathode (PBS, 25 mmol/L) in presence of glucose was (86.3±1.69)% within 24 h and sludge fermentation liquor was (74.1±1.44)% within 24 h. While the ErCAPof abiotic cathode under the same condition was only (57.9±1.94)% within 24 h. It suggested that biocathode could be a promising technology for reductive biodegradation of nitroaromatic antibiotics-containing wastewater in areas with relatively low annual mean temperature.

Reductive degradation of chloramphenicol in bioelectrochemical system

Fei Sun1, Aijie Wang2, Qun Yan1, and Guangsheng Zhang1

1School of Environmental and Civil Engineering,Jiangnan University,Wuxi214122,Jiangsu, China
2School of Municipal and Environmental Engineering,Harbin Institute of Technology,Harbin150090,Heilongjiang, China

biocatalyzed electrolysis systems, biocathode, chloramphenicol, ohm resistance, low temperature

Supported by: Industrialization Projects for University Scientific Research of Jiangsu Province (No. JHB2011-29), Natural Scientific Research Funding of Jiangsu Province (No. BK2012558).