孫湘婷，陳嬌婷

（贛南醫(yī)學(xué)院，江西贛州 341000）

ε-聚賴氨酸已于2003年10月被FDA批準(zhǔn)為安全的天然生物防腐劑[1]。日本窒素公司已將ε-聚賴氨酸的微生物發(fā)酵實(shí)現(xiàn)工業(yè)化，市場(chǎng)規(guī)模達(dá)數(shù)十億日元[2]。但目前國(guó)內(nèi)還處于實(shí)驗(yàn)室研發(fā)階段，主要是進(jìn)行ε-聚賴氨酸產(chǎn)生菌的誘變選育篩選高產(chǎn)菌株及發(fā)酵調(diào)控研究。傳統(tǒng)的ε-聚賴氨酸高產(chǎn)菌株篩選方法是通過(guò)菌株的平板分離獲得大量純培養(yǎng)物，然后隨機(jī)對(duì)每個(gè)純培養(yǎng)物進(jìn)行搖瓶發(fā)酵測(cè)定產(chǎn)量，從而篩選獲得高產(chǎn)菌株。傳統(tǒng)篩選方法工作量十分龐大繁瑣且盲目隨機(jī)。ε-聚賴氨酸高產(chǎn)菌株的篩選方法有兩種：一種是在SG培養(yǎng)基中加入0.002%美藍(lán)，該方法簡(jiǎn)單直觀，但美蘭對(duì)ε-聚賴氨酸產(chǎn)生菌產(chǎn)生很大的抑制作用，因此限制了其應(yīng)用[3-5]。另一種方法是通過(guò)在培養(yǎng)基中加入S-（2-氨基乙基）-L-半胱氨酸（AEC），篩選得到抗AEC的高產(chǎn)菌株，但AEC價(jià)格十分昂貴，研究的AEC需要量較大，因此成本太高也限制了其應(yīng)用[6-10]。本文提供一種簡(jiǎn)單、直觀、經(jīng)濟(jì)、快速的ε-聚賴氨酸高產(chǎn)菌的篩選模型，克服了傳統(tǒng)篩選模型的不足，大大地提高了篩選效率。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株S.albulus KCTC 9669 中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心；溴酚蘭、百里酚藍(lán)、溴百里酚藍(lán)、中性紅、甲基紅、酚紅、甲酚紅、酚酞、百里酚酞、NaH2PO4·2H2O、MgSO4·7H2O、（NH4）2SO4、NaCl、FeSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、NH4Mo7O24·4H2O、CuSO4·5H2O、CoCl2·6H2O、ZnSO4·7H2O、明 礬 、H3BO3、K2HPO4、KH2PO4、甘油 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；亮藍(lán)、檸檬黃、誘惑紅、莧菜紅 上海染料研究所有限公司；亞硝基胍 東京化成工業(yè)株式會(huì)社；AEC SIGMA公司；酵母浸出粉、麥芽浸出粉、葡萄糖、瓊脂 上海源聚生物科技有限公司；平板及斜面培養(yǎng)基（%）酵母浸出粉0.4，麥芽浸出粉1.0，葡萄糖0.4，pH7.3；SG固體培養(yǎng)基（%）[3]甘油1，瓊脂2，酵母浸出粉0.01，NaH2PO4·2H2O 0.0884，MgSO4·7H2O 0.025，（NH4）2SO40.066，痕量礦物溶液（培養(yǎng)基體積/礦物溶液體積=100/14），適量指示劑，pH7.0；痕量礦物溶液（%）NaCl 0.01，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01，CaCl2·2H2O 0.01，NH4Mo7O24·4H2O 0.001，CuSO4·5H2O 0.001，CoCl2·6H2O 0.01，ZnSO4·7H2O 0.01，明礬0.001，H3BO30.001；種子及發(fā)酵培養(yǎng)基（M3G）[6]（%）葡萄糖5，（NH4）2SO41，K2HPO40.08，KH2PO40.136，MgSO4·7H2O 0.05，ZnSO4·7H2O 0.004，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.003，酵母浸出粉0.5，pH6.8。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 新型篩選模型指示劑的選擇 SG固體培養(yǎng)基中加入各指示劑溶液，使培養(yǎng)基中各指示劑終濃度均為0.002%，混勻后倒入90mm平板，制成各指示劑平板。將濃度為1g/L ε-聚賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液200μL加入各指示劑平板的牛津杯中，以無(wú)菌蒸餾水為對(duì)照，1d后觀察平板。

1.2.2 新型篩選模型指示劑濃度的確定 SG固體培養(yǎng)基中加入終濃度為0.0002%～0.0040%的指示劑，將菌株S.albulus KCTC 9669的單孢子懸浮液適當(dāng)稀釋，涂至各濃度的指示劑平板中。30℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，觀察平板菌落生長(zhǎng)情況。根據(jù)平板上菌落的生長(zhǎng)情況及致死率確定添加指示劑的最佳濃度。

1.2.3 新型篩選模型的驗(yàn)證 從亞硝基胍（NTG）誘變后的兩個(gè)指示劑平板A和B中各挑取透明圈徑大小不一的菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，30℃培養(yǎng)4d。比較透明圈徑大小與菌株搖瓶發(fā)酵的ε-聚賴氨酸相對(duì)產(chǎn)量之間的關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 新型篩選模型指示劑的選擇

圖1 新型篩選模型指示劑的選擇Fig.1 The selection of indicator for the new screening method

表1 新型篩選模型指示劑的選擇Table 1 The selection of indicator for the new screening method

由圖1和表1可得，在中性紅平板上，裝有ε-聚賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)品的牛津杯周圍形成一個(gè)十分清晰明顯的色素透明圈。在誘惑紅、莧菜紅、亮藍(lán)、檸檬黃、溴酚蘭平板上，裝有ε-聚賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)品的牛津杯周圍形成較清晰明顯的色素聚集圈。在酚紅、酚酞、百里酚酞、甲基紅、甲酚紅、百里酚藍(lán)、溴百里酚藍(lán)平板上也形成色素聚集圈，但不清晰，界限不明顯。由于中性紅平板所形成的色素透明圈最清晰，且界限最明顯，所以選擇中性紅為新型篩選模型的指示劑。

2.2 新型篩選模型指示劑濃度的確定

中性紅的濃度太低，所形成的透明圈就不清晰，界限不明顯；而濃度太高又會(huì)對(duì)菌體的生長(zhǎng)產(chǎn)生一定的抑制作用，因此須確定合適的指示劑濃度，保證所形成的透明圈既清晰明顯又不會(huì)對(duì)菌體的生長(zhǎng)造成較大的抑制作用。由表2可知，當(dāng)中性紅濃度為0.0015%時(shí)，所形成的透明圈清晰明顯，而且對(duì)菌體生長(zhǎng)影響很?。ㄆ渲凶鳛閷?duì)照的0.002%的亞甲基蘭平板對(duì)菌的抑制率為91.8%，且第九天長(zhǎng)出單菌落）。因此確定新型篩選模型中性紅終濃度為0.0015%。

表2 新型篩選模型指示劑濃度的確定Table 2 The determination of the concentration of indicator in new screening method

2.3 新型篩選模型的驗(yàn)證

建立的新型篩選模型是否可靠，需要驗(yàn)證ε-聚賴氨酸產(chǎn)生菌所形成的透明圈徑大小與ε-聚賴氨酸相對(duì)產(chǎn)量是否正性相關(guān)。由表3可知，同一平板上透明圈徑越大的菌株其ε-聚賴氨酸相對(duì)產(chǎn)量就越高。

表3 新型篩選模型的驗(yàn)證Table 3 The testament of new screening method

3 結(jié)論

采用新型篩選模型可以通過(guò)目測(cè)直觀地從中性紅平板上篩選出ε-聚賴氨酸高產(chǎn)菌，而不用進(jìn)行繁瑣的搖瓶發(fā)酵篩選，大大減小篩選工作量，提高了篩選效率；也不用采用昂貴的AEC，節(jié)約了成本，既經(jīng)濟(jì)又高效，為ε-聚賴氨酸產(chǎn)生菌株和高產(chǎn)菌株的篩選工作提供了方便。

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