苗雯雯 田 磊 莊 木 劉玉梅 楊麗梅 張揚(yáng)勇 方智遠(yuǎn)

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所， 北京 100081）

當(dāng)前，甘藍(lán)（Brassica oleraceaL. var.capitataL.）的商業(yè)栽培品種中幾乎都是利用自交不親和系或雄性不育系配制的一代雜種。在甘藍(lán)育種實(shí)踐中，一代雜種的結(jié)實(shí)性對(duì)新品種的示范推廣進(jìn)程具有重要的影響，且與親本材料的自交不親和性（self-incompatibility，SI）存在著密切的聯(lián)系。甘藍(lán)屬于典型的孢子體型自交不親和體系，在遺傳上由一個(gè)具有多個(gè)復(fù)等位基因的S位點(diǎn)控制，又稱(chēng)S單元型（S haplotype）（Nasrallah & Nasrallah，1993）。目前已鑒定的涉及自交不親和識(shí)別反應(yīng)的重要S基因包括：S位點(diǎn)糖蛋白基因（S-locus glycoprotein，SLG）、S位點(diǎn)受體激酶基因（S-locus receptor kinase，SRK）、S位點(diǎn)富半胱氨酸蛋白基因（S-locus cysteinerich protein，SCR）或S位點(diǎn)蛋白11基因（（S-locus protein 11，SP11），其中SRK是雌蕊柱頭中表達(dá)的雌性決定因子（Kusaba et al.，2000），而SCR/SP11是花粉中的雄性決定因子（Schopfer et al.，1999 ）。在甘藍(lán)類(lèi)作物（包括結(jié)球甘藍(lán)、羽衣甘藍(lán)、抱子甘藍(lán)、球莖甘藍(lán)、花椰菜等）中，前人研究已鑒定出存在50多個(gè)S單元型（Ockendon，2000）。明確甘藍(lán)一代雜種中S單元型，有助于了解育成品種中優(yōu)勢(shì)S單元型的分布，并可為引入新的S單元型以及配制新組合提供參考依據(jù)。因此，在田磊等（2011）的研究基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)利用一套特異引物對(duì)SRK基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增、克隆測(cè)序及Blast分析序列信息，鑒定了23份甘藍(lán)一代雜種的S單元型，為甘藍(lán)新品種選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所育成的23份甘藍(lán)一代雜種，包括京豐、慶豐等20個(gè)通過(guò)全國(guó)（或北京市）審定（或鑒定）的不同類(lèi)型的商業(yè)品種，以及06-28、06-88等4個(gè)新組合（表1）。所有材料均于2012年在本所科研基地種植，并進(jìn)行統(tǒng)一的栽培管理。

表1 供試甘藍(lán)一代雜種的特征特性

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA的提取 取適量（約2 g）供試材料幼嫩的葉片，液氮研磨后利用改良的CTAB法（Doyle & Doyle，1990）提取DNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA濃度和純度；根據(jù)濃度大小分別稀釋到50 ng·μL-1，作為PCR擴(kuò)增的模板。

1.2.2 基因組DNA的PCR擴(kuò)增SRK基因激酶區(qū)的DNA片段由Ⅰ類(lèi)特異引物PK1/PK4（Nishio et al.，1997）和Ⅱ類(lèi)特異引物KD4/KD7（Park et al.，2002）進(jìn)行擴(kuò)增；若這2對(duì)引物均無(wú)目標(biāo)擴(kuò)增片段，則利用SRK基因激酶區(qū)的通用引物DF/DR進(jìn)行擴(kuò)增（表2）。Ⅰ類(lèi)特異引物PK1/PK4擴(kuò)增片段為SRK基因激酶區(qū)2～5外顯子序列，Ⅱ類(lèi)特異引物KD4/KD7擴(kuò)增片段為SRK基因激酶區(qū)4～7外顯子序列，引物DF/DR的擴(kuò)增片段為SRK基因激酶區(qū)5～7外顯子序列。

以基因組DNA為模板，利用以上3對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PK1/PK4的PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。KD4/KD7的PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，60℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，34個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。DF/DR的PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min，4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，恒壓130 V。利用紫外凝膠成像儀系統(tǒng)進(jìn)行拍照。PCR反應(yīng)體積為20 μL：模板DNA 4.0 μL，dNTPs（2.5 mmol·L-1）1.6 μL，10×Buffer（ 含 Mg2+）2.0 μL，Taq酶（2.5 U·μL-1）0.4 μL， 上 游 引 物（5 mmol·L-1）1.0 μL，下游引物（5 mmol·L-1）1.0μL，ddH2O 10μL。

表2 SRK基因激酶區(qū)特異引物

1.2.3 目的片段的回收克隆及序列分析 利用EasyPure Quick Gel Extraction Kit（北京全 式金生物技術(shù)有限公司）回收目標(biāo)片段，連接到pGEM-T Easy（Promega公司）載體上，4 ℃過(guò)夜。連接產(chǎn)物利用Trans1-T1 Phage Resistant感受態(tài)細(xì)胞（北京全式金生物技術(shù)有限公司）轉(zhuǎn)化，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，每個(gè)目標(biāo)片段的轉(zhuǎn)化樣品選3個(gè)陽(yáng)性克隆由生工生物工程（上海）有限公司測(cè)序。利用DNAStar軟件進(jìn)行序列拼接后，Blast以及BlastX在NCBI（http：// www.ncbi.nlm.nih.gov/）在線進(jìn)行，比對(duì)的Organism為Brassica oleracea（taxid：3712）。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘藍(lán)一代雜種S單元型的鑒定

SRK激酶區(qū)引物PK1/PK4的擴(kuò)增片段大小約為950 bp（圖1），引物KD4/KD7的擴(kuò)增片段大小約為1 100 bp（圖2）。PK1/PK4僅能擴(kuò)增Ⅰ類(lèi)甘藍(lán)材料，在18份材料中有目標(biāo)片段的擴(kuò)增；KD4/KD7僅能擴(kuò)增Ⅱ類(lèi)甘藍(lán)材料，在15份材料中有目標(biāo)片段的擴(kuò)增。因此，在23份供試甘藍(lán)一代雜種中，初步推斷慶豐、中甘15、8398等10份材料屬于Ⅰ類(lèi)和Ⅱ類(lèi)雜合體，京豐1號(hào)、中甘8號(hào)、中甘9號(hào)等8 份材料屬于Ⅰ類(lèi)雜合體，中甘11、中甘12、中甘22等5份材料屬于Ⅱ類(lèi)雜合體。

圖1 特異引物PK1/PK4的PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖2 特異引物KD4/KD7的PCR擴(kuò)增結(jié)果

對(duì)于屬Ⅰ類(lèi)和Ⅱ類(lèi)雜合體的慶豐、中甘15、8398等，利用以上兩對(duì)引物分別擴(kuò)增出的激酶區(qū)片段，進(jìn)行回收、克隆及測(cè)序分析確定其S單元型。中甘15、中甘17、中甘21和8398的母本具有相同的來(lái)源，它們的PK1/PK4擴(kuò)增片段克隆測(cè)序結(jié)果完全相同（918 bp），Blast比對(duì)表明，與Brassica oleracea SRK28基因（GenBank：AB0190355.1）在序列覆蓋率為100%下核苷酸序列相似性為100%（E值為0）。因此，這4份甘藍(lán)一代雜種均含有S28單元型。8398和中甘21的父本雖然來(lái)源不同，但它們的KD4/KD7擴(kuò)增片段克隆測(cè)序結(jié)果完全相同（1 043 bp），BlastX比對(duì)表明，可能的氨基酸序列均與Brassica oleracea SRK5（GenBank：CAB41878.1）的氨基酸序列相似性為99%（序列覆蓋率98%，E值為0），僅415～417 bp處的氨基酸F（苯丙氨酸）與SRK5蛋白的氨基酸L（亮氨酸）不同，二者均屬于非極性疏水氨基酸。因此，推測(cè)8398和中甘21含有S5單元型。采用同樣的方法，鑒定了其余屬Ⅰ類(lèi)和Ⅱ類(lèi)雜合體的甘藍(lán)品種的S單元型（表3）。其中，慶豐的PK1/PK4擴(kuò)增片段克隆測(cè)序未能確定其具體的Ⅰ類(lèi)S單元型，將其暫命名為Sn。

本試驗(yàn)中，供試甘藍(lán)一代雜種的親本材料均為高代自交系或雄性不育系，理論上是同一S單元型的純合體，因此，雜種的S單元型同時(shí)含有雙親的S單元型。以上推測(cè)在屬Ⅰ類(lèi)和Ⅱ類(lèi)雜合體的慶豐、中甘15、8398等S單元型測(cè)定中得到驗(yàn)證。對(duì)于同屬Ⅰ類(lèi)（或Ⅱ類(lèi)）雜合類(lèi)型的材料，擴(kuò)增條帶為單一條帶，少量的克隆測(cè)序難以區(qū)分其中含有不同的S單元型，在未知S單元型的情況下設(shè)計(jì)僅擴(kuò)增雜合體中的每個(gè)Ⅰ類(lèi)S單元型的特異引物比較困難。因此Ⅰ類(lèi)雜合體的京豐1號(hào)、中甘8號(hào)等，以及屬于Ⅱ類(lèi)雜合體的中甘11、中甘12等材料，通過(guò)對(duì)其父、母本純合體的S單元型進(jìn)行鑒定，推測(cè)配制的一代雜種的S單元型（表3）。

晚豐僅在KD4/KD7擴(kuò)增得到目標(biāo)條帶，起初推測(cè)其為Ⅱ類(lèi)雜合體。利用其父母本鑒定其S單元型時(shí)，首先確定其中一個(gè)親本為S2，而另一個(gè)親本在PK1/PK4和KD4/KD7中均沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物，由此推測(cè)可能是該親本的S單元型中SRK基因的激酶區(qū)不能用以上兩對(duì)引物擴(kuò)增得到。因此，利用在Ⅰ類(lèi)和Ⅱ類(lèi)S單元型中均有擴(kuò)增產(chǎn)物的引物DF/DR進(jìn)行擴(kuò)增（圖3），擴(kuò)增片段大小為750 bp，測(cè)序分析鑒定該材料的S單元型為S68，因此屬Ⅰ類(lèi)和Ⅱ類(lèi)雜合類(lèi)型（S68S2）。

表3 23個(gè)甘藍(lán)一代雜種S單元型的鑒定結(jié)果

2.2 S單元型在甘藍(lán)一代雜種中的分布

圖3 利用特異引物DF/DR對(duì)甘藍(lán)一代雜種的PCR擴(kuò)增

通過(guò)序列分析鑒定S單元型，供試23個(gè)甘藍(lán)一代雜種中有8個(gè)Ⅰ類(lèi)S單元型S7、S16、S28、S35、S45、S57、S68和未知的Sn，Ⅱ類(lèi)S單元型有S2、S5、S15。其中Ⅰ類(lèi)和Ⅱ類(lèi)雜合體所占的比例最大，約占47.8%；其次為Ⅰ類(lèi)雜合體，約占34.8%；而Ⅱ類(lèi)雜合體，約占17.4%。S單元型中出現(xiàn)頻率最高的是Ⅱ類(lèi)的S5，達(dá)到19.6%；其次為Ⅰ類(lèi)的S28，約占17.4%。由此可知，Ⅱ類(lèi)S5單元型是組成供試甘藍(lán)一代雜種的主要S單元型，這可能與骨干親本的應(yīng)用頻率較高有關(guān)。總體來(lái)說(shuō)，與甘藍(lán)類(lèi)作物已鑒定的50多個(gè)S單元型相比，供試品種中出現(xiàn)的S單元型的數(shù)目不多，為了避免配制的雜交組合出現(xiàn)雜交不結(jié)實(shí)現(xiàn)象，在今后的甘藍(lán)遺傳育種中引進(jìn)和利用更多的S單元型是十分重要的。

表4 23個(gè)甘藍(lán)一代雜種S單元型的分布

3 結(jié)論與討論

在本試驗(yàn)中，根據(jù)慶豐的PK1/PK4擴(kuò)增片段序列未能確定該品種的Ⅰ類(lèi)S單元型（序列已登錄到GenBank：JX840774），表明該S單元型（暫命名為Sn）可能是已鑒定的S單元型中未公開(kāi)序列的，也可能是甘藍(lán)中尚未被鑒定的新S單元型，進(jìn)一步測(cè)定其SRK的S區(qū)、SCR/SP11、SLG等基因序列的分析鑒定工作正在進(jìn)行中。

本試驗(yàn)中，大部分甘藍(lán)一代雜種的親本為自交不親和系，如中甘18，其親本為S28和S57，都屬于Ⅰ類(lèi)S單元型，表現(xiàn)為強(qiáng)自交不親和性；而有的親本材料則為自交親和系，如中甘21的父本，屬于Ⅱ類(lèi)的S5單元型，表現(xiàn)為強(qiáng)自交親和性。以上結(jié)果驗(yàn)證了Ⅰ類(lèi)S單元型具有較強(qiáng)的SI性，而Ⅱ類(lèi)S單元型的SI性相對(duì)較弱，與Ockendon（1982）提出的甘藍(lán)中S5和S15純合體的自交不親和性更弱，更容易出現(xiàn)自交親和材料的結(jié)論基本一致。

在選育甘藍(lán)自交系時(shí)，需要經(jīng)過(guò)自交分離以及定向選擇的過(guò)程，自交多代后才能獲得具有穩(wěn)定的、優(yōu)良性狀的自交系，這就容易造成一些S單元型的丟失。方智遠(yuǎn)等（1983）利用花期雜交授粉的方法研究金早生、黑葉小平頭等15份自交不親和系間的親和關(guān)系，指出這15份材料中涉及到13個(gè)不同的S單元型。Ockendon（1982）利用熒光顯微法對(duì)197份甘藍(lán)類(lèi)材料（包括紫甘藍(lán)、皺葉甘藍(lán)）的S單元型進(jìn)行鑒定，共發(fā)現(xiàn)了31個(gè)S單元型，其中在甘藍(lán)中發(fā)現(xiàn)了21個(gè)S單元型。Sakamoto等（2000）對(duì)31個(gè)甘藍(lán)一代雜種的SLG基因進(jìn)行PCR-RFLP分析，鑒定出15個(gè)S單元型，但比Ockendon（1982）多了4個(gè)新的S單元型（S33、S35、S51、S57）。在甘藍(lán)類(lèi)作物中已鑒定出的S單元型有50多個(gè)，而甘藍(lán)栽培品種中僅約占一半，表明在甘藍(lán)栽培品種的選育過(guò)程中S單元型的丟失十分嚴(yán)重。本試驗(yàn)中甘藍(lán)一代雜種中涉及的S單元型僅有11個(gè)，可能與在培育新品種時(shí)利用骨干親本的頻率比其他材料的頻率高有關(guān)。育種材料中S單元型類(lèi)型少，會(huì)增加配制雜種的親本間雜交不親和的發(fā)生頻率。06-88是由兩個(gè)來(lái)源不同的優(yōu)良高代自交不親和系配制而成的優(yōu)良品種，但在利用蜜蜂繁殖一代雜種時(shí)結(jié)實(shí)率很低，致使繁種不成功。本試驗(yàn)中S單元型鑒定結(jié)果揭示，這是由于雙親S單元型相同引起的嚴(yán)重雜交不親和所致。因此，開(kāi)展甘藍(lán)材料的S單元型鑒定研究，并在今后的甘藍(lán)遺傳育種中引進(jìn)和利用更多的S單元型是十分重要的。

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田磊，莊木，劉玉梅，楊麗梅，張揚(yáng)勇，方智遠(yuǎn)．2011．兩個(gè)甘藍(lán)自交系自交不親和S單元型的初步鑒定．中國(guó)蔬菜，（4）：8-12.

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