林黛琴 萬承波 王婷婷

(江西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)院，江西 南昌 330029)

1 引言

豆芽是老百姓餐桌上最普通不過的蔬菜，風(fēng)味獨(dú)特，清香脆嫩，深受人們喜愛，它被當(dāng)今世界稱之為“天然和健康”食物引領(lǐng)風(fēng)騷者之一，在國外也非常流行。在歐洲、美洲、亞洲的許多國家都有豆芽的專門制造廠，但在我們國家還存一些小作坊，小商販的豆芽加工企業(yè)，而有些商販為降低成本，提高利潤(rùn)，在豆芽生產(chǎn)過程中非法添加植物激素6－芐氨基嘌呤等促生長(zhǎng)劑。6－芐氨基嘌呤是一種廣譜植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，可顯著促進(jìn)柑桔?；ū９坝坠L(zhǎng)，打破再生芽休眠等［1］，但從食品安全的角度來看，植物生長(zhǎng)促進(jìn)劑和其他農(nóng)藥一樣，也有一定的毒性［2］。

隨著植物生長(zhǎng)促進(jìn)劑的廣泛應(yīng)用，濫用及施用不當(dāng)導(dǎo)致的食品安全問題逐漸增多，它的殘留問題也引起社會(huì)的重視［3］，但對(duì)其限量標(biāo)準(zhǔn)的研究卻較少［4］。因此進(jìn)行食品中植物生長(zhǎng)促進(jìn)劑的殘留分析研究很有必要，另也有助于更好地研究其在植物體內(nèi)的代謝、降解和作用機(jī)制。目前6－芐氨基嘌呤的檢測(cè)方法主要有紫外分光光度法［5］和高效液相色譜［6－7］，但豆芽中 6－芐氨基嘌呤高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定方法報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC－MS/MS技術(shù)，對(duì)樣品前處理過程進(jìn)行了簡(jiǎn)化，建立了豆芽中6－芐氨基嘌呤的定性和定量分析方法。該技術(shù)具有檢測(cè)限低，靈敏度高、準(zhǔn)確可靠等優(yōu)點(diǎn)，該法簡(jiǎn)便易行，準(zhǔn)確可靠，可降低檢測(cè)成本，節(jié)省分析時(shí)間，適于生產(chǎn)質(zhì)量控制。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器

Agilent6410A液相－串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Agilent公司)配有agilent1200高效液相色譜儀及電噴霧離子源，Milli－Q超純水器 (美國 Millipore公司)，IKA T25均質(zhì)器(德國IKA公司)，SI Vortex Genie 2漩渦混合器(美國Scientific Industries公司)，KQ－600DE型數(shù)控超聲清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)，SIGMA 3－18K低溫離心機(jī)(德國SIGMA公司)。

2.2 試劑

6－芐氨基嘌呤(純度＞98%，德國Dr.Ehrenstorfer公司)，甲醇(色譜純，美國Fisher公司)，甲酸(色譜純，美國TEDIA公司)，乙酸(色譜純，美國TEDIA公司)，Milli－Q 超純水、0.1%甲酸水溶液(體積分?jǐn)?shù))、0.1%甲酸甲醇溶液(體積分?jǐn)?shù))、酸化甲醇(0.05%乙酸)。標(biāo)準(zhǔn)工作液系列:0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、10.0、20.0 μg/L。

2.3 實(shí)驗(yàn)條件

2.3.1 色譜條件 色譜柱:資生堂MGⅡ－C185 μm 2.1 mm ×150 mm，進(jìn)樣量:5 μL ，柱溫:35 ℃，流速:0.3 ml/min，流動(dòng)相 A:0.1%甲酸甲醇，流動(dòng)相B:含0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫條件

3.00 56 44 0.303.25 56 44 0.304.5 50 50 0.308.00 50 50 0.30

2.3.2 質(zhì)譜條件 ESI(+)離子源:霧化氣太壓力:45psi、毛細(xì)管電壓4000V、離子源源溫度100℃;脫溶劑氣溫度:350℃;脫溶劑氣流量:8L/min。6－芐氨基嘌呤的監(jiān)測(cè)離子對(duì)、保留時(shí)間、解離電壓和碰撞能量列于表2。

表2 6－芐氨基嘌呤質(zhì)譜分析優(yōu)化參數(shù)

2.4 樣品制備

稱取200 g豆芽樣品，破碎均勻，然后稱取5 g(精確至0.01 g)固體樣品置于50 ml離心管中，均質(zhì)1min，準(zhǔn)確加入10 ml酸化甲醇，渦旋1 min后，超聲提取30 min，于4℃ 6000 r/min冷凍離心機(jī)中離心5 min，移取酸化甲醇層到另一離心管中，殘?jiān)?0 ml酸化甲醇再次提取，合并有機(jī)相，定容至25 ml容量瓶中，從中取2.5mL用50%甲醇水稀釋到25mL，取適量過0.22μm聚四氟乙烯膜，直接上LC－MS/MS測(cè)定。

3 結(jié)果與討論

3.1 高效液相色譜條件的優(yōu)化

分別對(duì)資生堂 MGⅡ C18柱5μm 2.0mm ×150 mm和 ZORBAX Eclipse XDB － C18 柱 3.5μm 2.1 mm×100 mm，兩種不同高效液相色譜柱進(jìn)行了比較，資生堂MGⅡ C18柱5μm 2.0mm ×150 mm色譜柱從分離度、峰形方面都比較理想，因此本文選擇了MGⅡ C18柱5μm 2.0mm ×150 mm高效液相色譜柱。在對(duì)6－芐氨基嘌呤液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方面研究中，為了優(yōu)化流動(dòng)相，我們考察了不同體系當(dāng)流動(dòng)相:5mmol乙酸銨水溶液(含0.1%甲酸)－甲醇、水(含0.1%甲酸)－甲醇、水(含0.1%甲酸)－乙腈、水(含0.1%甲酸)－甲醇(0.1%甲酸)的色譜效果，實(shí)驗(yàn)表明，水(含0.1%甲酸)－甲醇(0.1%甲酸)做為流動(dòng)相并采用梯度洗脫時(shí)，分析目標(biāo)物的分離度和靈敏度較高，因此選擇了該體系作為實(shí)驗(yàn)的流動(dòng)相(梯度洗脫條件見表1)。

3.2 質(zhì)譜定量定性

根據(jù)6－芐氨基嘌呤分子結(jié)構(gòu)的特征，實(shí)驗(yàn)選用電噴霧正離子(ESI+)電離模式對(duì)0.1mg/L標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行Q1全掃描;并確定6－芐氨基嘌呤電離出的母離子，繼續(xù)對(duì)其進(jìn)行Q3全掃描，找出2個(gè)信號(hào)較強(qiáng)的碎片離子與母離子組成監(jiān)測(cè)離子對(duì):m/z 226/91.0(定量)、226/147.9(如圖1所示)。繼而以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式優(yōu)化了解離電壓、碰撞能量等各種參數(shù)，優(yōu)化后的參數(shù)見(表2)所示。

圖1 6－芐氨基嘌呤標(biāo)準(zhǔn)溶液的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)色譜圖

3.2 前處理?xiàng)l件優(yōu)化

6－芐氨基嘌呤難溶于水，在甲醇和乙腈的溶解度較高，在酸、堿性條件下比較穩(wěn)定，因質(zhì)譜掃描方式選擇了正離子掃描模式，所以考察了酸化乙腈、酸化甲醇、酸化甲醇水溶液、酸化乙腈水溶液四種不同提取溶液的提取效率進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明提取率:酸化甲醇≈酸化乙腈＞酸化甲醇水溶液＞酸化乙腈水溶液態(tài)度?？紤]到實(shí)驗(yàn)用的流動(dòng)相為甲醇，且從實(shí)驗(yàn)安全角度來講甲醇的毒性比乙腈小，因此本方法最終定酸化甲醇作為提取溶劑。

3.3 分析方法線性相關(guān)性及方法的檢出限

在優(yōu)化的液相色譜及質(zhì)譜條件下，對(duì)一定范圍濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在選定的條件下時(shí)測(cè)定，用質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)繪制工作曲線見圖2所示，在0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、10.0、20.0 μg/L 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(R2)為0.9996，線性方程:y=22477.7561x－1750.5236。樣品經(jīng)前處理后進(jìn)行分析，得到方法檢出限(信噪比 S/N=3) 為 2.2 μg/kg、方法的定量檢出限7.3μg/kg(信噪比S/N=10)。

圖2 6－芐氨基嘌呤工作曲線圖

3.4 回收率、精密度實(shí)驗(yàn)及實(shí)際樣品檢測(cè)

采用上述的實(shí)驗(yàn)方法在豆芽樣品添加6－芐氨基嘌呤標(biāo)液做加標(biāo)回收和精密度實(shí)驗(yàn)，分別添加了3個(gè)不同濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)添加水平重復(fù)測(cè)定6次，計(jì)算回收率及精密度(以相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差表示)，3 個(gè)質(zhì)量濃度的加標(biāo)水平分別為:0.2、1.0、2.0μg/L，平均加標(biāo)回收率和精密度結(jié)果見表3。剖析結(jié)果，本方法有良好的回收率和精密度滿足痕量分析要求。

3.5 實(shí)際樣品的測(cè)定

從菜市場(chǎng)隨機(jī)選取4種豆芽進(jìn)行分析，測(cè)定其中的6－芐氨基嘌呤殘留量，其中2家豆芽檢出了6－芐氨基嘌呤，殘留量分別為7.5μg/kg和9.2μg/kg，表明確實(shí)存在一些不法企業(yè)無視國家有關(guān)規(guī)定，將6－芐氨基嘌呤用于豆芽加工生產(chǎn)中。陽性樣品及樣品加標(biāo)色譜圖見圖3所示。

表3 6－芐氨基嘌呤的回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差及檢出限(n=6)

圖3 a陽性樣品色譜圖，b樣品加標(biāo)色譜圖

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了豆芽中6－芐氨基嘌呤植物生長(zhǎng)促進(jìn)劑殘留的HPLC－MS/MS檢測(cè)方法，該方法具有樣品處理簡(jiǎn)單、測(cè)定周期短、靈敏度高及選擇性強(qiáng)(質(zhì)譜的監(jiān)測(cè)模式為MRM，選擇標(biāo)準(zhǔn)待測(cè)物的母離子所得到的兩個(gè)定性子離子及保留時(shí)間來定性，選擇性較好)、回收率穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，適用于大量樣品的快速篩選、測(cè)定，同時(shí)也為執(zhí)法機(jī)構(gòu)的監(jiān)督提供科學(xué)理論依據(jù)的技術(shù)支撐。

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