李粉玲 蔡漢權(quán) 林曼莎

(廣東韓山師范學(xué)院，廣東 潮州 521041)

多糖的種類很多，其中的活性多糖可以刺激免疫活性，能增強(qiáng)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬腫瘤細(xì)胞的作用，促進(jìn)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，激活T細(xì)胞和B細(xì)胞，并促進(jìn)抗體的形成。從而在一定程度上具有抗腫瘤的活性。但對于腫瘤細(xì)胞并無直接的殺傷作用?；钚远嗵悄芙档图谆戄煺T發(fā)腫瘤的發(fā)生率，對一些易發(fā)生廣泛轉(zhuǎn)移，不宜采取手術(shù)治療和放射療法的白血病，淋巴瘤等。當(dāng)前，對多糖的研究方興未艾，關(guān)于多糖的生物活性、作用機(jī)制、構(gòu)效關(guān)系以及結(jié)構(gòu)修飾等一直是研究的重點(diǎn)，對于指導(dǎo)多糖應(yīng)用開發(fā)和加速多糖產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程具有重要作用。［1，2］

多糖作為水果中的一類重要結(jié)構(gòu)物質(zhì)與功能物質(zhì)，在各種水果中均大量存在。水果多糖不僅賦予其水果特定的感官品質(zhì)，而且在保鮮等方面也有顯著的作用。近年來對水果多糖的研究已漸漸深入，大量的水果資源已被利用，我國是水果生產(chǎn)大國，擁有豐富的水果資源，這就為水果多糖的分離提取提供了大量價(jià)格低廉的原料，也為水果多糖的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供了較大發(fā)展空間。［3］

草莓，別名洋莓、地莓、地果、紅莓等。草莓屬薔薇科?！侗静菥V目》注釋:補(bǔ)脾氣，固元?dú)?，制伏亢陽，扶持衰土，壯精神，益氣，寬痞，消痰，解酒毒，止酒后發(fā)渴，利頭目，開心益志。對人體有較大的藥用價(jià)值，總糖含量高。本實(shí)驗(yàn)將利用超聲波技術(shù)這一現(xiàn)代手段輔助提取草莓多糖。

多糖的提取方法有水提醇沉法、酶解法、微波法、膜處理法、超聲波輔助提取法等。本實(shí)驗(yàn)采用超聲波輔助提取法(Ultrasonic assisted extraction)。［4］是利用超聲波增大物質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)頻率和速度，增加溶劑穿透力，提高藥物溶出速度和溶出次數(shù)，縮短提取時(shí)間的浸提方法。超聲波提取法具有提取效率高、提取時(shí)間短、提取溫度低、適應(yīng)性廣、提取藥液雜質(zhì)少、提取工藝運(yùn)行成本低等優(yōu)點(diǎn)。超聲波提取水果多糖具有提取時(shí)間短、得率高，操作方便等優(yōu)點(diǎn)。［5］

本實(shí)驗(yàn)用苯酚－硫酸法測定多糖含量，在490 nm波長處有特征吸收，測定多糖含量。測定吸光度時(shí)所用葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液與蓮霧多糖都需現(xiàn)配現(xiàn)用才能保證結(jié)果的穩(wěn)定性及準(zhǔn)確性，每組需平行測定3次。用分光光度法測定草莓中多糖的含量，此方法簡單，準(zhǔn)確率高。且生成的顏色持久，用苯酚－硫酸法測定多糖含量時(shí)需注意苯酚濃度不宜太高，這樣反應(yīng)的穩(wěn)定性不好且易產(chǎn)生操作誤差。本實(shí)驗(yàn)采用5%濃度的苯酚，測定結(jié)果較為理想。同時(shí)保持較高的硫酸濃度對多糖含量測定非常重要，因此該呈色反應(yīng)是以對多糖的水解和糠醛反應(yīng)為基礎(chǔ)的，硫酸濃度降低會(huì)影響兩種反應(yīng)的進(jìn)行。［6，7］

1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器

1.1 材料

草莓(采自潮州市)。

1.2 試劑

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，95%乙醇、苯酚、濃硫酸及其他試劑均為分析純。

5.0%苯酚試劑的配制:稱取苯酚100 g，加鋁片0.1g和 NaHCO30.05g蒸餾，收集1820C餾分。稱取7.5g，加水150mL溶解，置棕色瓶內(nèi)放冰箱備用，得5.0%苯酚試劑。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:準(zhǔn)確稱取干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品0.1g，加適量水溶解，轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，加蒸餾水至刻度搖勻，制得濃度為1mg/mL的葡萄糖溶液，再準(zhǔn)確移取10mL，用蒸餾水定容至100mL，得0.1mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液。

1.3 儀器

移液管，吸量管;容量瓶;碘量瓶;離心管;試管;

722SP可見分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司);

SHD－III循環(huán)水式多用真空泵(保定高新區(qū)陽光科教儀器廠);

101A－1型電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司);

冷藏冷凍箱(BCD－217YBHaier);

FA2004N電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司);

KDM型調(diào)溫電熱套(山東鄄城永興儀器廠);

800型離心沉淀器(上海手術(shù)器械廠);

粉碎機(jī)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 草莓多糖的提取工藝

2.1.1 草莓的預(yù)處理

2.1.1.1 將草莓洗凈切碎，放在101A－1型電熱鼓風(fēng)干燥箱以60℃左右烘烤，粉碎，過40目篩，于試劑瓶中密封備用。

2.1.1.2 準(zhǔn)確稱取 10.00g草莓粉于索氏提取器中用石油醚(80℃)回流脫脂兩次，1 h/次，每次60 mL。用無水乙醇回流提取兩次，1h/次，每次60 mL。除去單糖和低聚糖，將其烘干。［8］進(jìn)行稱重。將其平均分成10份，記錄每份樣品的重量。按照此步驟處理樣品50.00g 。

2.2 提取工藝

草莓清洗→烘干(50—70℃)→粉碎→加一定量蒸餾水→超聲提取→過濾→濃縮→加乙醇得粗多糖→重新溶解→加Savage試劑脫蛋白、加高嶺土脫色→萃取→過濾→定容→測定多糖含量

2.3 多糖含量的測定:苯酚 －硫酸法

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作:分別吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液(0.1 mg/mL)0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，加水稀釋至 1mL，向各管中加入5%苯酚試劑1mL，混勻。沿管壁加入濃硫酸5mL，靜置5min，振搖，定容至25ml比色管，振搖，置沸水浴中加熱15min，立即轉(zhuǎn)入冷水浴中冷卻至室溫。以蒸餾水為空白，在490nm波長處測定吸光度。

2.4 回歸方程的建立

以葡萄糖的含量(mg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度(A)為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線得直線回歸方程y=2.07x+0.02920，r=0.9899 。

表1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 1 glucose standard curve

2.5 草莓多糖含量測定

取草莓多糖浸提液溶于適量蒸餾水中，轉(zhuǎn)移到100mL容量瓶中，定容。精密吸取上述溶液1.0mL，按“標(biāo)準(zhǔn)曲線制作”項(xiàng)下操作，測定吸光度，根據(jù)回歸方程求出含量。

計(jì)算公式:

式中c為標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的葡萄糖濃度(mg/mL)，V為草莓多糖溶液稀釋后的總體積(mL)，W為提取多糖時(shí)稱取的草莓重量(g)。

3 結(jié)果與討論

3.1 單因素試驗(yàn)

3.1.1 單因素試驗(yàn)工藝流程

取5份回流烘干好的草莓粉末分別放入5個(gè)碘量瓶中，按一定比例加入蒸餾水(料液比)，在合適功率(超聲波功率)下超聲波浸提數(shù)分鐘(浸提時(shí)間)，浸提結(jié)束后趁熱減壓抽濾，收集濾液。

加熱濃縮至2－3mL(原料重:濃縮液=1:2)。

上清液加入8mL體積的無水乙醇，充分?jǐn)嚢?，放入冰箱中靜置2小時(shí)，沉淀物用無水乙醇洗滌，如此重復(fù)數(shù)次，直到乙醇接近無色，得到的沉淀即為粗多糖。

得到的粗多糖加50mL的蒸餾水使其重新溶解，加入 Sevage 試劑［9，10］(正丁醇:氯仿 =5:1)，振蕩15min，加高嶺土0.1g，混勻，靜置2小時(shí)，脫去蛋白、脫色，過濾，取其濾液，用蒸餾水溶解后定容100mL容量瓶中，利用苯酚－硫酸法測其吸光度A，根據(jù)回歸方程可算出多糖的含量W。

原料的超聲波浸提時(shí)間、超聲波功率、料液比以及超聲波浸提次數(shù)對多糖的提取結(jié)果均有影響，據(jù)以上流程，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以多糖提取量為指標(biāo)進(jìn)行正交試驗(yàn)，確定超聲波萃取草莓多糖的最佳條件。以提取多糖的因素為橫坐標(biāo)，多糖含量(mg/g)為縱坐標(biāo)做圖分析比較。

3.1.2 超聲波浸提時(shí)間對草莓多糖提取的影響

取5份回流烘干好的草莓粉末分別置于250mL碘量瓶中，按照料液比1∶40加入40mL水，在超聲波功率 60%(300W)條件下分別浸提 10、15、20、25、30min，趁熱過濾，苯酚 －硫酸法測定多糖的提取量。結(jié)果見圖2。

圖2 草莓多糖含量與超聲波浸提時(shí)間的關(guān)系Figure2 Effects of microwave extraction time on the content of strawberry polysaccharide

從圖2看出超聲波加熱浸提20min時(shí)多糖提取量最大，浸提時(shí)間小于20min多糖提取不充分，浸提時(shí)間大于20min，隨著時(shí)間的延長，多糖提取量逐漸降低，說明超聲波浸提時(shí)間對多糖的提取有影響。

3.3.2 超聲波浸提功率對草莓多糖提取的影響

取5份回流烘干好的草莓粉末分別置于250mL碘量瓶中，加入40mL蒸餾水，分別在20%、40%、60%、80%、100%(100%功率為500W)功率下加熱浸提20min，趁熱過濾，苯酚 －硫酸法測定多糖含量計(jì)算提取量，結(jié)果見圖3。

圖3 草莓多糖含量與超聲波浸提功率的關(guān)系Figure 3 Effects of microwave power on the content of strawberry polysaccharide

由圖3看出草莓多糖的提取量先是隨著超聲波功率的增加而增大，功率60%時(shí)多糖提取量最大。由圖可見，超聲波提取功率對多糖的提取有顯著的影響。

3.3.3 料液比對草莓多糖提取的影響

將5份回流烘干好的草莓粉末分別置于250mL碘量瓶中，按料液比 1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70 加入相應(yīng)體積的水，超聲波功率60%(300W)，加熱浸提20min，測定多糖提取量，結(jié)果見圖4。

圖4 草莓多糖含量與料液比的關(guān)系Figure 4 Effects of solid－liquid ratio on the content of strawberry polysaccharide

由上圖可以知道，當(dāng)料液比是1:50的時(shí)候，提取率達(dá)到最高，所以選擇料液比為1:50為最佳提取條件。

3.3.4 超聲波浸提次數(shù)對草莓多糖提取量的影響

將3份回流烘干好的草莓粉末分別置于250mL碘量瓶中，根據(jù)上述試驗(yàn)所得最佳浸提條件:浸提時(shí)間20min、微波功率80%，料液比1:50、研究多糖浸提次數(shù)對多糖提取量的影響，分別浸提一至三次，結(jié)果見圖5。

圖5 草莓多糖含量與超聲波浸提次數(shù)的關(guān)系Figure 5 Effects of times on the content of strawberry polysaccharide

由圖5可看出二次浸提時(shí)樣品液中多糖含量達(dá)到最大值，因此二次浸提為最佳的浸提次數(shù)。

3.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上 ，經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定以提取時(shí)間，提取功率，料液比和提取次數(shù)為因素，設(shè)計(jì)四因素三水平的L9(34)正交試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2，表3。

表2 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

表3 L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果

表2中極差值大小反映出影響草莓多糖提取率的主次因素順序?yàn)?浸提時(shí)間＞超聲波功率＞浸提次數(shù)＞料液比，經(jīng)方差分析顯示浸提時(shí)間和料液比是顯著影響因素。

4 結(jié)論

4.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)通過三水平四因素正交試驗(yàn)，確定了草莓多糖的最佳提取條件，即為:超聲波浸提時(shí)間為25min、超聲波功率60%(3000W)、料液比1∶40，浸提次數(shù)2次，草莓多糖在該條件下的提取量達(dá)到14.97mg/g。

4.2 前景展望

近幾年來研究較多的是草莓的冰溫保鮮技術(shù)以及草莓果實(shí)總DNA提取技術(shù)的改進(jìn)，目前對植物多糖的提取技術(shù)有較深入的研究，對于提取果實(shí)多糖的研究，目前仍處于初始研究階段，相關(guān)文獻(xiàn)只表明草莓具有豐富的營養(yǎng)價(jià)值，總糖含量高，因此研究如何利用超聲波提取草莓多糖，大大提高了草莓的利用價(jià)值，具有一定的開發(fā)意義。

［1］鄭宇東，鄭金貴，曾紹校.果蔬多糖的研究現(xiàn)狀及應(yīng)用前景［J］.食品科學(xué)，2003，2(1):152 －155.

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