杜瑞平 溫雅俐* 姚焰礎(chǔ) 江 山 高 民＊＊

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學院動物營養(yǎng)研究所，呼和浩特 010031;2.重慶市畜牧科學院動物營養(yǎng)研究所，重慶 402460)

荷斯坦奶牛具有耐寒不耐熱的特性，炎熱的夏季，特別是高濕高熱的南方地區(qū)，奶牛容易發(fā)生熱應激［1］，造成養(yǎng)殖效益嚴重下滑。熱應激時，奶牛表現(xiàn)為呼吸加快、體溫升高、散熱量減少，從而導致食欲下降，采食量和產(chǎn)奶量顯著降低［2］;另外，生理代謝紊亂，內(nèi)分泌發(fā)生改變，直接導致奶牛的免疫力和繁殖性能顯著降低［3］。因此，確定熱應激對奶牛代謝和生產(chǎn)性能影響的程度及作用機理，研發(fā)配套的熱應激緩解技術(shù)并最終提高奶牛福利和牛場養(yǎng)殖效益已成為動物營養(yǎng)工作者的重要任務之一。國內(nèi)外學者關(guān)于奶牛熱應激已做了大量的研究，主要集中在熱應激對奶牛生理機能［4－7］、采食消化［8－10］、血液生理生化指標［11－12］、瘤胃內(nèi) 環(huán) 境［13－15］、生 產(chǎn) 性 能［2，16－17］以 及 繁 殖 性能［18－20］等影響的研究上，而關(guān)于熱應激時奶牛瘤胃內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)變化的研究較少。因此，本試驗采用實時熒光定量PCR技術(shù)研究熱應激對不同泌乳階段奶牛瘤胃液微生物數(shù)量的影響，旨在為改善和緩解熱應激的不良影響提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

采用2×3交叉試驗設(shè)計，選擇18頭經(jīng)產(chǎn)中國荷斯坦奶牛，根據(jù)試驗前1周胎次、平均泌乳天數(shù)和產(chǎn)奶量相近的原則，分為泌乳前期(產(chǎn)后15～100d)組、泌乳中期(產(chǎn)后112～175d)組、泌乳后期(產(chǎn)后200～230d)組(表1)，每組6個重復，根據(jù)實測的牛場溫濕指數(shù)(temperature and humidity index，THI)變化，采用熱應激與非熱應激的自身對照試驗。預試期為15d，正試期分為熱應激期(2010年7月20日—2010年8月30日)和非熱應激期(2010年8月31日—2010年9月28日)。熱應激期按照 Armstrong［21］的評價(即 THI＜ 72無熱應激反應;72～79輕度熱應激;80～89中度熱應激;90及以上嚴重危險)又相應分為熱應激前期(2010年7月20日—2010年8月9日)、熱應激中期(2010年8月10日—2010年8月13日)和熱應激后期(2010年8月14日—2010年8月30日)。

表1 試驗分組Table 1 Experimental groups

1.2 飼養(yǎng)管理與試驗飼糧

按牛場正常飼養(yǎng)管理規(guī)程進行。試驗奶牛飼養(yǎng)于含有雙側(cè)排風扇的拴系式雙列對頭牛舍(鐘樓式)中，每頭奶牛定欄定位飼喂，每天飼喂3次，即05:00～06:00、12:30～13:30、17:00～18:00。飼喂方式為先粗后精。精料定量飼喂，粗料自由采食，自由飲水。試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平見表2。

1.3 牛場THI的測定

在牛舍的中部和兩端距地面1.5 m高處分別掛置干濕球溫度計(河北武強滏陽儀表廠生產(chǎn)，有效量程:0～40℃，相對濕度:10% ～100%)，保證溫濕度表的有效通風，防止陽光照射和雨淋，并避免奶牛觸及。每天08:00、14:00、20:00記錄干球溫度和濕球溫度，求3次平均值。計算公式為:

式中:Td為干球溫度(℃)，Tw為濕球溫度(℃)。

1.4 奶牛直腸溫度、體表溫度和呼吸頻率的測定

分別于熱應激前、中和后期及非熱應激期選擇2d，在每天08:00、14:00、20:00分3次測定供試奶牛的直腸溫度、體表溫度和呼吸頻率，取均值用于輔助熱應激狀態(tài)的判定。具體方法參照《家畜環(huán)境衛(wèi)生學》［22］。

1.5 瘤胃液的采集與處理

分別于熱應激的前、中和后期以及非熱應激期選擇1d，在中午限制飼喂之后(14:00～15:00)，于18頭奶牛中隨機選擇6頭采集瘤胃液［22］，方法:奶牛綁定，口腔插管，用泵抽取瘤胃液。每頭奶牛采集200 mL，分別裝到10 mL滅菌離心管中，于－80℃保存以備微生物數(shù)量的測定。

1.6 微生物數(shù)量的測定

1.6.1 主要試劑

總 RNA提取試劑(Trizol，Invitrogen，美國);反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Bio-Serve，上海);普通PCR擴增試劑盒(Hot-start PCR Mix，Bio-Serve，上海);實時熒光定量PCR試劑盒(SYBR Green I PCR Mix，Bio-Serve，上海)。

1.6.2 主要儀器

普通 PTC－200 PCR儀(MJ，美國);電泳儀(Bio-Rod，美國);組織勻漿儀(Pro Scientific，美國);NanoDrop1000微量分光光度計(Thermo，美國);凝膠成像分析儀(UVP，美國);5417R離心機(Eppendorf，德國);ABI7500實時熒光定量 PCR儀(ABI，美國)。

1.6.3 瘤胃液的預處理以及DNA的提取

1)瘤胃液樣本完全融化后，先用200目小塊紗布覆蓋于管口，然后倒置并用新的2 mL滅菌離心管收集約600 μL濾液，殘留物保存于－80℃;

2)將上步的600 μL濾液12 000 r/min離心10 min，留下沉淀繼續(xù)裂解，上清液約500 μL裝于新的2 mL滅菌離心管中－80℃保存?zhèn)溆?

3)在上步沉淀中加入500 μL一步法裂解液，振蕩混勻1 min，100 ℃煮10 min，12 000 r/min離心10 min后取上清液約500 μL裝于新的2 mL滅菌離心管中;

4)將上步上清液12 000 r/min離心10 min，取上清液約400 μL裝于新的1.5 mL滅菌離心管中作為PCR擴增模板。

表2 試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 2 Composition and nutrient levels of experimentaldiets(DM basis) %

1.6.4 引物設(shè)計

引物的設(shè)計與合成參考高愛武［23］的方法，并在此基礎(chǔ)上做了改進。委托專業(yè)技術(shù)公司合成。具體引物設(shè)計見表3。凍干粉狀態(tài)的引物離心后，用滅菌超純水配制成 100 μmol/L貯備液和20 μmol/L工作液，－20 ℃保存。

1.6.5 實時熒光定量PCR反應體系和條件

實時熒光定量PCR反應體系見表4。

優(yōu)化反應程序:95℃預變性3 min;95℃變性30 s，55 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸 30 s，35 ～40 個循環(huán);72℃最終延伸15 min。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計利用SAS 9.0軟件包中的平衡試驗設(shè)計方差分析過程(ANOVA)，均值的多重比較采用Duncan氏法進行，結(jié)果用平均值±標準誤來表示，其中 P＜0.05表示組間差異顯著，P＜0.01表示組間差異極顯著。

表3 引物設(shè)計Table 3 Primerdesign

表4 實時熒光定量PCR反應體系Table 4 Real-time fluorescence quantitative PCR reaction system

2 結(jié)果

2.1 牛舍環(huán)境溫度與THI的變化及試驗期奶牛直腸溫度、體表溫度和呼吸頻率

5～25℃的環(huán)境溫度是奶牛的適溫區(qū)，當牛舍溫度高于25℃或者THI＞72，即引起奶牛的熱應激［24］。由表5可看出，在熱應激前、中和后期牛舍平均氣溫在29.43～36.83℃，超出了奶牛的適溫區(qū)。由于試驗所在地濕度較高，所以選用THI作為評價指標較為適宜。熱應激前、中和后期牛舍平均THI在80.92～88.53之間，而非熱應激期牛舍的THI＜72。判斷奶牛熱應激的首要標準是THI，其次可結(jié)合生理指標進行判斷。奶牛正常直腸溫度為37.50～39.50℃，而奶牛正常呼吸頻率為10～30次/min，生理指標一方面可與正常水平進行比較，另一方面看這些指標在熱應激期和非熱應激期是否差異顯著。所以THI再結(jié)合表6中生理指標可知，熱應激期整個牛場的奶牛處于中度熱應激狀態(tài)。

表5 牛舍環(huán)境溫度與THITable 5 Environmental temperature and THI in the house ofdairy cows

表6 試驗期奶牛直腸溫度、體表溫度和呼吸頻率表6 The rectum temperature，skin temperature and respiratory rate ofdairy cows in trial period

2.2 熱應激對奶牛瘤胃液微生物數(shù)量的影響

2.2.1 熱應激對奶牛瘤胃液總細菌數(shù)量的影響

奶牛瘤胃液微生物在39.0～39.5℃最活躍，高于此溫度對瘤胃發(fā)酵不利［25］?？梢?，熱應激對奶牛瘤胃微生物有一定的影響。由表7可看出，泌乳中、后期組奶牛熱應激期的瘤胃液總細菌數(shù)量極顯著低于非熱應激期(P＜0.01)，而泌乳前期組奶牛熱應激前、中、后期及整個熱應激期的瘤胃液總細菌數(shù)量均極顯著高于非熱應激期(P＜0.01)。而且不同泌乳階段組奶牛瘤胃液總細菌數(shù)量差異極顯著(P＜0.01)，在熱應激中期，THI最高時，泌乳前、中期組奶牛瘤胃液總細菌數(shù)量極顯著高于泌乳后期(P＜0.01)，但在整個熱應激期，泌乳前、中期組奶牛瘤胃液總細菌數(shù)量變化趨勢一致即先升高后降低，而泌乳后期組呈增加趨勢。

表7 熱應激對奶牛瘤胃液總細菌數(shù)量的影響Table 7 Effects of heat stress on the number of total bacteria in rumen fluid ofdairy cows 106copies/mL

2.2.2 熱應激對奶牛瘤胃液厭氧真菌數(shù)量的影響

由表8可看出，泌乳前期組奶牛在熱應激前、中、后期及整個熱應激期的瘤胃液厭氧真菌數(shù)量均極顯著高于非熱應激期(P＜0.01)，但泌乳中、后期組奶牛該指標熱應激期與非熱應激期差異不顯著(P＞0.05)。且同一熱應激期不同泌乳階段組奶牛瘤胃液厭氧真菌數(shù)量差異極顯著(P＜0.01)，但規(guī)律不一致。

表8 熱應激對奶牛瘤胃液厭氧真菌數(shù)量的影響Table 8 Effects of heat stress on the number of anaerobic fungi in rumen fluid ofdairy cows106copies/mL

2.2.3 熱應激對奶牛瘤胃液纖維分解菌數(shù)量的影響

瘤胃中的纖維降解菌主要包括產(chǎn)琥珀酸擬桿菌、黃化瘤胃球菌、白色瘤胃球菌和一些溶纖維丁酸弧菌［26］。

由表9可看出，泌乳前、中期組奶牛熱應激期瘤胃液產(chǎn)琥珀酸擬桿菌數(shù)量極顯著高于非熱應激期(P＜0.01)，而泌乳后期組奶牛瘤胃液產(chǎn)琥珀酸擬桿菌數(shù)量則呈相反規(guī)律(P＜0.01)，同一熱應激期不同泌乳階段組奶牛瘤胃液產(chǎn)琥珀酸擬桿菌數(shù)量差異極顯著(P＜0.01)，但規(guī)律性不一致。

表9 熱應激對奶牛瘤胃液產(chǎn)琥珀酸擬桿菌數(shù)量的影響Table 9 Effects of heat stress on the number of Bacteroides succinogenes in rumen fluid ofdairy cows 104copies/mL

由表10可看出，泌乳前期組奶牛熱應激前、中、后期及整個熱應激期瘤胃液白色瘤胃球菌數(shù)量均極顯著高于非熱應激期(P＜0.01)，而泌乳中、后期組奶牛熱應激期的瘤胃液白色瘤胃球菌數(shù)量則呈相反規(guī)律(P＜0.01)，且不同泌乳階段組奶牛在同一熱應激期的瘤胃液白色瘤胃球菌數(shù)量差異極顯著(P＜0.01)，泌乳前期組的白色瘤胃球菌數(shù)量均極顯著高于中、后期(P＜0.01)。

由表11可看出，泌乳前、后期組的奶牛熱應激前、中、后期及整個熱應激期瘤胃液黃化瘤胃球菌數(shù)量極顯著高于非熱應激期(P＜0.01)，且不同泌乳階段組奶牛同一應激期瘤胃液黃化瘤胃球菌數(shù)量差異極顯著(P＜0.01)，但無規(guī)律性。

2.2.4 熱應激期奶牛瘤胃液微生物數(shù)量與THI的相關(guān)性分析

由表12可以看出，整個熱應激期的THI與泌乳前期組奶牛瘤胃液總細菌數(shù)量(P＜0.01)、厭氧真菌數(shù)量(P＜0.05)、白色瘤胃球菌數(shù)量(P＜0.01)和黃化瘤胃球菌數(shù)量(P＜0.05)有較強的相關(guān)性，而泌乳中、后期組奶牛的瘤胃液微生物數(shù)量僅泌乳后期組奶牛瘤胃液的黃化瘤胃球菌數(shù)量與THI有極顯著相關(guān)性(P＜0.01)，其他相關(guān)性均不顯著(P ＞0.05)。

表10 熱應激對奶牛瘤胃液白色瘤胃球菌數(shù)量的影響Table 10 Effects of heat stress on the number of Ruminococcus albus in rumen fluid ofdairy cows 106copies/mL

表11 熱應激對奶牛瘤胃液黃化瘤胃球菌數(shù)量的影響Table 11 Effect of heat stress on the number of Ruminococcus flavefaciens in rumen fluid ofdairy cows 106copies/mL

表12 熱應激期奶牛瘤胃液微生物數(shù)量與THI的相關(guān)性分析Table 12 Correlation analysis between microbial number in rumen fluid ofdairy cows and THI in heat stress period

3 討論

3.1 試驗期間牛舍THI的變化

West等［2］認為，盡管白天的較高氣溫、相對濕度和輻射使奶牛產(chǎn)生明顯的熱應激反應，但夜間給予奶牛充足的降溫時間，奶牛仍可耐受較高的白天溫度。Igono等［27］也報道，盡管白天氣溫較高，但只要夜間低于21℃維持3～6 h將降低產(chǎn)奶量的下降程度。其他研究者認為，環(huán)境改變與動物反應之間存在延遲效應，但也有使用當天環(huán)境狀況來評價熱應激對奶牛生產(chǎn)性能影響的報道［28］。West等［2］報道，在熱天提前 2d 的 THI對當天的產(chǎn)奶量的影響最大，且提前2天的氣溫對干物質(zhì)采食量的影響最敏感。前2天平均THI每增加1單位，荷斯坦奶牛產(chǎn)奶量下降0.88 kg，而干物質(zhì)采食量在環(huán)境溫度每增加1℃時，下降0.85 kg。而本試驗中，熱應激期間，即使在夜間，牛舍的平均最低THI仍＞72，奶牛仍然處于熱應激狀態(tài)。本試驗同期相關(guān)研究(生理、生產(chǎn)試驗)表明，奶牛熱應激時部分指標有延遲效應，而部分指標與當天的THI相關(guān)性較強［29］。因此，本試驗采用當天的THI來判斷與奶牛熱應激的相關(guān)性。

3.2 熱應激對奶牛瘤胃液微生物數(shù)量的影響

早期的瘤胃微生物研究一般采用50年代Hungate設(shè)計的體外滾管培養(yǎng)法和微生物厭氧培養(yǎng)技術(shù);20世紀80年代，以核糖體RNA為主的分子生物學技術(shù)發(fā)展迅速并應用于瘤胃微生物的研究;現(xiàn)在人們可以應用現(xiàn)代分子生物學技術(shù)更全面地鑒定瘤胃微生物的種類，完善微生物的分類系統(tǒng)。

瘤胃是一個動態(tài)的、開放的微生態(tài)系統(tǒng)，其微生物區(qū)系主要有細菌、原蟲及厭氧真菌組成。眾所周知，反芻動物是粗飼料的主要利用者，纖維物質(zhì)主要在瘤胃中被降解和消化，瘤胃的這種強效降解作用是依靠瘤胃微生物來完成的，其中纖維分解菌發(fā)揮著重要的作用。瘤胃中的纖維降解菌主要包括產(chǎn)琥珀酸擬桿菌、黃化瘤胃球菌、白色瘤胃球菌和一些溶纖維丁酸弧菌。2種瘤胃球菌是反芻動物瘤胃中降解植物細胞壁活性最高的革蘭氏陽性菌。白色瘤胃球菌和黃化瘤胃球菌均能產(chǎn)生大量的纖維素酶和半纖維素酶，其中主要是木聚糖酶。產(chǎn)琥珀酸擬桿菌為革蘭氏陰性菌，不運動，纖維分解活性很高，是瘤胃纖維分解菌的優(yōu)勢菌株之一，但不能降解木聚糖，其純培養(yǎng)菌具有很強的降解結(jié)構(gòu)性堅韌物質(zhì)(如秸稈)的能力，能夠降解一些黃化瘤胃球菌所不能降解的某些同質(zhì)異晶體纖維素，是研究纖維素酶最早的瘤胃菌株之一［30］。

瘤胃微生物對溫度要求較嚴格，在39.0～39.5℃時最活躍，高于此溫度對瘤胃發(fā)酵不利。而且瘤胃內(nèi)纖維分解菌對pH也有較嚴格的要求，pH 6.6 ～7.0 最為活躍，對纖維消化較好［25］，而熱應激時，奶牛流涎增多，采食量下降，這必然導致瘤胃的pH變化，造成消化障礙［31］?？梢?，熱應激對奶牛瘤胃微生物有一定的影響，但對每一種微生物的影響不盡一致。Tajima等［28］報道，不同環(huán)境溫度對熱應激青年牛瘤胃微生物組成無顯著影響，但受相對濕度和體重影響較大。李旦等［32］報道，熱應激對不同個體奶牛間產(chǎn)琥珀酸擬桿菌和黃化瘤胃球菌數(shù)量影響差異較小。王建平等［33］利用實時熒光定量PCR技術(shù)定量6種纖維分解菌數(shù)量的研究結(jié)果表明，在熱應激狀態(tài)下，奶牛瘤胃中黃化瘤胃球菌和棲瘤胃普雷沃氏菌數(shù)量變化較大。

本研究結(jié)果中，在熱應激條件下，泌乳前期組奶牛的幾種微生物數(shù)量和泌乳后期組的黃化瘤胃球菌數(shù)量及泌乳中期組的產(chǎn)琥珀酸擬桿菌數(shù)量均極顯著高于非熱應激期。同時，泌乳中、后期組奶牛瘤胃液總細菌數(shù)量和白色瘤胃球菌數(shù)量及泌乳后期組的產(chǎn)琥珀酸擬桿菌數(shù)量則顯著低于非熱應激期。這些研究結(jié)果與前人不盡一致，本試驗同期進行的生產(chǎn)性能試驗結(jié)果表明，熱應激的同一階段及非熱應激期條件下，不同泌乳階段的試驗牛采食量無顯著差異，而同一泌乳階段條件下，非熱應激期采食量顯著高于熱應激期。同時，熱應激條件下，泌乳前期的試驗牛揮發(fā)性脂肪酸、氨氮濃度顯著高于泌乳中、后期［29］。所以，泌乳前期與中、后期試驗牛采食量無顯著差異的情況下，由于瘤胃發(fā)酵特性的不同，導致微生物數(shù)量的差異。當然還可能與不同泌乳階段奶牛飼糧結(jié)構(gòu)、生理狀態(tài)等差異有關(guān)，有待持續(xù)深入的研究加以驗證說明。

4 結(jié)論

①泌乳前期組奶牛熱應激期的瘤胃液各類微生物數(shù)量均極顯著高于非熱應激期，但對泌乳中、后期組的各類微生物數(shù)量影響無規(guī)律性。

②熱應激THI與泌乳前期組奶牛瘤胃液總細菌數(shù)量、厭氧真菌數(shù)量、白色瘤胃球菌數(shù)量和黃化瘤胃球菌數(shù)量有較強的相關(guān)性，而THI與泌乳中、后期組奶牛的這些指標相關(guān)性較差，說明泌乳前期瘤胃液微生物數(shù)量對熱應激的反應更敏感。

［1］ 謝江昂，傅童生.奶牛熱應激研究進展［J］.動物醫(yī)學進展，2008，29(9):82 －85.

［2］ WEST J W，MULLINIX B G，BERNARD J K.Effects of hot，humid weather of milk temperature，dry matter intake，and milk yield of lactatingdiary cows［J］.Journal of Dairy Science，2003，86:232 －242.

［3］ 莫放.養(yǎng)牛生產(chǎn)學［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)大學出版社，2003:2.

［4］ BERMAN Y，F(xiàn)OLMAN M，KAIM M，et al.Upper critical temperatures and forced ventilation effects for high-yieldingdairy cows in a subtropical climate［J］.Journal of Dairy Science，1985，68:1488 －1495.

［5］ 安代志.高溫環(huán)境的評定及其高產(chǎn)奶牛體溫調(diào)節(jié)特性［D］.碩士學位論文.南京:南京農(nóng)業(yè)大學，2005:6.

［6］ 李忠浩，王麗.熱應激對荷斯坦奶牛生理常數(shù)的影響［J］.湖北農(nóng)業(yè)科學，2009，48(9):2205 －2207.

［7］ 張峰，王學清，李魁英.熱應激下奶牛體溫、呼吸頻率與環(huán)境溫濕指數(shù)的相關(guān)性［J］.飼料工業(yè)，2010，31(13):24－25.

［8］ SAIADY M Y，SHAIKH M A，MUFARREJA S I，et al.Effect of chelated chromium supplementation on lactation performance and blood parameters of Holstein cows under heat stress［J］.Animal Feed Science and Technology，2004，117:223 －233.

［9］ SOLIMAN E，ABOLEL-MOTY A，F(xiàn)AHMY S，et al.Some physiological responses of lactating Friesian cows todietary fat supplementation［J］.Alexandria Journal of Agricultural Research，2001，46:21 －29.

［10］ 薛白，王之盛，李勝利，等.溫濕指數(shù)與奶牛生產(chǎn)性能的關(guān)系［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2010，37(3):153－157.

［11］ 李建國，桑潤滋，張正珊，等.熱應激對奶牛生理常值、血液生化指標、繁殖及泌乳性能的影響［J］.河北農(nóng)業(yè)大學學報，1998(4):69－70.

［12］ WISE M E，ARMSTRONG D V，HUBER J，et al.Hormonal alteration in the lactationdairy cow in response to thermal stress［J］.Journal of Dairy Science，1998，71:2480 －2484.

［13］ 王建平，王加啟，卜登攀，等.高溫條件下高產(chǎn)和中產(chǎn)奶牛產(chǎn)奶性能及瘤胃發(fā)酵的研究［J］.動物營養(yǎng)學報，2010，22(1):51 －56.

［14］ SCHNEIDER P，SKLAN D，CHALUPA W，et al.Feeding calcium salts of fatty acids to lactating cows［J］.Journal of Dairy Science，1988，71(8):2143 －2150.

［15］ BAUMGARD L H，WHEELOCK J B，SHWARTZ G，et a1.Effects of heat stress on nutritional requirements of lactatingdairy cattle［C］//Proceedings of the 5th annual Arizonadairy production conference.Arizona:The University of Arizona，2006:8 －16.

［16］ UMPHREY J E，MOSS B R，WILCOX C J，et al.Interrelationships in lactating Holsteins of rectal and skin temperatures，milk yield and composition，dry matter intake，body weight，and feed efficiency in summer in Alabama［J］.Journal of Dairy Science，2001，84:2680－2685.

［17］ 楊毅，梁榮嶸，劉慶華，等.輕微至中度熱應激對荷斯坦奶牛生理指標及產(chǎn)奶性能的影響［J］.中國農(nóng)學通報，2009，25(24):28 －31.

［18］ 唐俊英.熱應激對奶牛生產(chǎn)力的影響［J］.中國奶牛，2000(2):27－28.

［19］ JORDAN E R，SCHOUTEN M J，QUAST J W，et al.Comparison of two timed artificialinsemination(TAI)protocols for management of first insemination postpartum［J］.Journal of Dairy Science，2002，85:1002－1008.

［20］ BRYANT J R，LOPEZ-VILLALOBOS N，PRYCE J E.et al.Environmental sensitivity in New Zealanddairy cattle［J］.Journal of Dairy Science，2007，90:1538－1547.

［21］ ARMSTRONG D V.Heat stress interaction with shade and cooling［J］.Journal of Dairy Science，1994，77:2044 －2050.

［22］ 李如治.家畜環(huán)境衛(wèi)生學［M］.3版.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2003:42－43.

［23］ 高愛武.分別驅(qū)除厭氧真菌和原蟲對綿陽瘤胃微生物種群及纖維物質(zhì)降解的影響［D］.博士學位論文.呼和浩特:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學，2008.

［24］ 李如治.奶牛熱應激研究現(xiàn)狀［J］.中國奶牛，1995(4):38－40.

［25］ 廖曉霞，葉均安.泌乳奶牛熱應激研究進展［J］.中國飼料，2005(19):21－23.

［26］ HOBSON P N，STEWART C S.Rumen microbial ecosystem［M］.London:Blackie Academic＆ Professional，1997.

［27］ IGONO M O，BJOTVEDT G，SANFORD-CRANE H T.Environmentalprofile and criticaltemperature effects on milk production of Holstein cows indesert climate［J］.International Journal of Biometeorology，1992，36:77 －87.

［28］ TAJIMA K，NONAKA I，HIGUCHI K，et al.Influence of high temperature and humidity on rumen bacterialdiversity in Holstein heifers［J］.Anaerobe，2007，13(2):57 －64.

［29］ 溫雅俐.熱應激對奶牛生產(chǎn)性能及生理機能的影響［D］.碩士學位論文.呼和浩特:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學，2011.［30］ KOIKE S，KOBAYASHI Y.Fibrolytic rumen bacteri

a:their ecology and functions［J］.Asian-Australia

Journal of Animal Science，2009，22(1):131 －138.［31］ 高民，杜瑞平，溫雅俐.熱應激對奶牛生產(chǎn)的影響及

應對策略［C］//發(fā)展低碳農(nóng)業(yè)應對氣候變化－低碳

農(nóng)業(yè)研討會論文集.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2010.

［32］ 李旦，王加啟，卜登攀，等.應用Real-time PCR方法測定瘤胃液功能菌群數(shù)量［J］.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學報，2008，16(5):787 －791.

［33］ 王建平，王加啟，卜登攀，等.熱應激對奶牛瘤胃纖維分解菌的影響［J］.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學報，2010，18(2):302－307.