高權(quán)新 王進(jìn)波 尹 飛 馬向明 施兆鴻

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)院東海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部東海與遠(yuǎn)洋漁業(yè)資源開發(fā)利用重點實驗室，上海 200090;2.浙江大學(xué)寧波理工學(xué)院，分子設(shè)計與營養(yǎng)工程重點實驗室，寧波 315100;3.中國石油大學(xué)國家大學(xué)科技園管理委員會，東營 257091)

熒光蛋白已在生命科學(xué)領(lǐng)域被廣泛利用，成為了當(dāng)今生物學(xué)研究者強(qiáng)有力的幫手?？茖W(xué)家們利用這一先進(jìn)的工具，在整個生物學(xué)界掀起了生物技術(shù)革命，比如利用三磷酸鳥苷(GTP)標(biāo)記腦組織，可以監(jiān)控腦神經(jīng)細(xì)胞的生長等，這無疑是生物學(xué)史上的奇跡。本文闡述了熒光蛋白的發(fā)現(xiàn)、發(fā)展及利用，展示了熒光蛋白空前的顯像技術(shù)及其他一系列強(qiáng)大的功能，概括了在動物營養(yǎng)相關(guān)領(lǐng)域的研究進(jìn)展，以期為我國的生物學(xué)以及動物營養(yǎng)學(xué)研究者提供新的思路和方法。

1 熒光蛋白的發(fā)現(xiàn)及其作用機(jī)理

1962年，下村修在一種生活在北冰洋寒冰水域的水母——維多利亞多管水母(Aequorea victoria，圖1)體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)，并純化了GFP。馬丁·沙爾菲發(fā)現(xiàn)了GFP的價值，并第1次運(yùn)用GFP這個神奇工具投入試驗研究。1994年錢永健改造了GFP，使得GFP的熒光變強(qiáng)、變色。這3位科學(xué)家由此獲得了2008年諾貝爾化學(xué)獎［1-2］。從此，熒光蛋白帶來了生物技術(shù)的新革命。

從水母體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的GFP是由238個氨基酸構(gòu)成，第65、66、67位氨基酸(Ser-Tyr-Gly)形成發(fā)光團(tuán)，經(jīng)共價鍵連接而形成對羥苯甲基咪唑烷酮，可被光激發(fā)產(chǎn)生熒光［3-4］。許多科學(xué)家利用熒光蛋白的發(fā)光機(jī)理，將水母中熒光蛋白基因提取出來，轉(zhuǎn)入其他生物體內(nèi)，使得生物變幻的多姿多彩。2000年，熒光兔(圖2)在法國誕生［5］，隨后熒光貓(圖 3)［6］、熒光鼠(圖 4)［7］相繼問世。2006 年 12月24日，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)的劉忠華教授主持的轉(zhuǎn)基因克隆豬課題獲得成功(圖5)［8］。

2 GFP在生物領(lǐng)域的最新應(yīng)用進(jìn)展

2.1 顯像技術(shù)

由于熒光蛋白有多種顏色，且穩(wěn)定、無毒，所以熒光蛋白可使得動物體內(nèi)復(fù)雜的系統(tǒng)結(jié)構(gòu)可視化。Livet等［9］用多種不同顏色的熒光蛋白對神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行了基因標(biāo)記，使得我們能夠觀察到大腦的集成線路圖，可以直觀地看到神經(jīng)細(xì)胞以及細(xì)胞間的相互作用。圖6中五彩繽紛的色彩形象地展現(xiàn)了復(fù)雜的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。另外，熒光蛋白還可用于生物發(fā)育領(lǐng)域，能夠形象的觀察生物體的器官組織結(jié)構(gòu)的變化，隨著發(fā)育學(xué)研究的深入，熒光蛋白必將成為強(qiáng)有力的工具［10］。Wan等［11］發(fā)現(xiàn)用GFP標(biāo)記斑馬魚的胰臟，可以清楚地觀察到胰臟外分泌部位的發(fā)育(圖7)。

圖1 維多利亞多管水母Fig.1 Aequorea victoria

圖2 綠色熒光兔Fig.2 GFP bunny［5］

圖3 放射紅色熒光貓F(tuán)ig.3 RFP cats［6］

2.2 示蹤技術(shù)

一般的熒光染料標(biāo)記的微生物，由于其生長快、分裂多，染料可在短時間內(nèi)被稀釋，所以不能實時準(zhǔn)確地觀察微生物侵入活體動物以及細(xì)胞的過程。近年發(fā)現(xiàn)，熒光蛋白可用于示蹤流行性病毒對活體細(xì)胞的感染，流行性病毒可被實時監(jiān)控，借助于這一新技術(shù)，我們可以更深入地研究其感染方式［12］。Zhao 等［13］發(fā)現(xiàn)用 GFP 標(biāo)記細(xì)菌，可以詳細(xì)地對細(xì)菌的入侵進(jìn)行時空檢測，以確定細(xì)菌特異性的感染部位以及傳染源的空間位移。GFP克服了一般熒光染料所帶有的缺陷，GFP必將會進(jìn)一步地取代一般的熒光染料，有效地幫助學(xué)術(shù)研究者觀察分析細(xì)菌、病毒的感染方式。

圖4 綠色熒光鼠Fig.4 GFP rats［7］

圖5 綠色熒光豬Fig.5 GFP pigs［8］

2.3 報告基因

由于熒光蛋白發(fā)光團(tuán)的形成不具物種專一性，可發(fā)出熒光穩(wěn)定，且不需依賴任何輔因子或其他基質(zhì)而發(fā)光，所以轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞后的熒光蛋白基因很穩(wěn)定，對多數(shù)宿主的生理無影響，是理想的報告基因。熒光蛋白作為報告基因，可顯示生物體1個或多個基因的表達(dá)的狀況［14］，并可對活體細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)運(yùn)動和細(xì)胞元件間的互作進(jìn)行實時熒光顯像，且直觀、準(zhǔn)確。Gregor等［15］構(gòu)建了bicoid(一種成形素)與GFP的融合蛋白，通過直接光漂白和間接對bicoid擴(kuò)散常數(shù)的估測，使研究者能直接地觀察到bicoid輸送的實時影像，幫助研究者更好地了解bicoid成形素梯度的穩(wěn)定性和核動態(tài)。

圖6 腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)Fig.6 Neuronal network architecture［9］

圖7 用GFP標(biāo)記的斑馬魚胰臟的外分泌部位Fig.7 Exocrine pancreas-specific expression of GFP in zebrafish［11］

2.4 生物光學(xué)感受器

熒光蛋白由于其獨特的光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，適于用作活細(xì)胞內(nèi)的光學(xué)感受器?，F(xiàn)在許多研究者將具有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的分子識別位點結(jié)合到熒光蛋白分子上來設(shè)計成生物感受器。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，利用GFP感受器可以檢測多種分子(如核酸、激素)的表達(dá)狀況，甚至可以檢測活體細(xì)胞中蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化，其潛在應(yīng)用前景極為廣闊［16-17］。

Taniguchi等［18］構(gòu)建了一種黃色熒光蛋白融合庫(YFP fusion library)作為單分子感受器，可以有效用于分析大腸桿菌單細(xì)胞中蛋白質(zhì)和mRNA表達(dá)水平的關(guān)系。

2.5 篩選技術(shù)

利用GFP可顯色的特點，我們還可對需要的物質(zhì)進(jìn)行篩選和純化。比如增強(qiáng)型GFP(enhanced green fluorescent protein，eGFP)融合蛋白可被熒光激活細(xì)胞分選術(shù)(FACS)有效地篩選，生產(chǎn)出穩(wěn)定的人類糖皮質(zhì)激素受體配體結(jié)合域(human glucocorticoid receptor ligand-bindingdomain，hGRLBD)［19］。不僅如此，GFP還可用于檢驗玉米胚乳和胚芽提取物的篩選和純化重組蛋白的效力［20］。GFP篩選技術(shù)已在生命科學(xué)的多個領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用和認(rèn)可。

2.6 抗體生產(chǎn)

由于新型病毒的鑒別特征有限，使得傳統(tǒng)的抗體生產(chǎn)方法不能被有效運(yùn)用，生產(chǎn)抗體便遇到了極大的困難，而GFP的發(fā)現(xiàn)及其在分子生物學(xué)中的應(yīng)用解決了這一難題。Steela等［21］將新型的病毒——葫蘆黃發(fā)育遲緩癥病毒(cucurbit yellow stuntingdisorder virus，CYSDV)外殼蛋白植入GFP基因，并轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，再將農(nóng)桿菌接入本生煙用于生產(chǎn)該病毒，然后再用GFP純化的重組蛋白-CYSDV便可制備多克隆免疫抗體［21］?？焖凫`活的GFP抗體生產(chǎn)技術(shù)在應(yīng)對新型流行性病毒、及時控制疫情等方面必定會發(fā)揮巨大的作用。

3 GFP在動物營養(yǎng)相關(guān)領(lǐng)域的研究和應(yīng)用

3.1 益生菌在動物胃腸道中的動態(tài)檢測

GFP在生物學(xué)方面的技術(shù)開發(fā)和應(yīng)用推廣，必然推動動物營養(yǎng)學(xué)研究的發(fā)展。現(xiàn)在GFP已經(jīng)應(yīng)用于飼用益生菌的動態(tài)監(jiān)測，并且表現(xiàn)出了良好的研究和應(yīng)用前景。鄺哲師等［22］構(gòu)建了表達(dá)GFP基因的重組的芽孢桿菌，將含0.1%重組的芽孢桿菌的全價配合飼料投喂仔豬和小雞后，發(fā)現(xiàn)36 h后小雞盲腸內(nèi)的該菌的數(shù)量達(dá)到了(155±33)×105個/g，48 h后仔豬盲腸內(nèi)該菌的數(shù)量達(dá)到了(135±35)×105個/g，說明該菌可以在腸道內(nèi)迅速復(fù)活并繁殖成為益生菌。Yu等［23］運(yùn)用GFP示蹤技術(shù)，深入研究了德氏乳桿菌在雞胃腸道中的黏附和定植情況，其試驗結(jié)果顯示，將乳桿菌飼喂雞6 h后，可以在雞的胃、空腸、回腸、盲腸中觀測到該菌，42 h后，該菌在各腸段的數(shù)量達(dá)到最大值(105.5)。利用GFP示蹤技術(shù)，可以直觀地觀察到GFP重組菌在腸道黏膜中的定植、在局部區(qū)域的繁殖以及擴(kuò)散到整個腸道的過程，使整個動態(tài)過程可視化，這對研究益生菌的益生機(jī)制提供了有力的技術(shù)［24］。這些研究成果為深入地探索微生態(tài)制劑的作用機(jī)制提供了依據(jù)，同時進(jìn)一步證實了GFP作為新的基因報告在微生物動態(tài)檢測方面有著廣泛的應(yīng)用前景。

3.2 營養(yǎng)物質(zhì)在胃腸道內(nèi)的動態(tài)觀察

邊慧慧等［25］首次采用帶有GFP質(zhì)粒的大腸桿菌作為蛋白質(zhì)指示劑，簡單、直觀、形象地指示了魚類攝食飼料后不同時間食糜蛋白質(zhì)在消化道內(nèi)的分布狀況。同時，利用GFP還可以通過測定黏膜上皮細(xì)胞、組織的熒光強(qiáng)度初步估計蛋白質(zhì)的消化吸收情況。采用GFP觀測營養(yǎng)物質(zhì)在胃腸道內(nèi)的流通與變化，使得抽象的營養(yǎng)消化與吸收變得清晰、具體。

3.3 飼料原料的改良

由于GFP熒光的產(chǎn)生無需輔助因子和底物，可在活細(xì)胞或組織中進(jìn)行熒光檢測，不會對植物的生長發(fā)育產(chǎn)生毒害，所以GFP已經(jīng)在轉(zhuǎn)基因植物中已經(jīng)成為了一個非常有效的報告基因。提高飼用植物中的含硫氨基酸水平是動物營養(yǎng)研究者們關(guān)注的一個焦點，因為含硫氨基酸對奶制品、羊毛產(chǎn)量及肉類都有重要的影響，關(guān)寧等［26］將玉米醇溶蛋白(γ-zein，有含硫氨基酸的蛋白質(zhì))基因和玉米醇溶蛋白和菜豆球蛋白的融合基因(z-eolin)分別與植物表達(dá)載體pCABIA1302的GFP報告基因融合，通過遺傳轉(zhuǎn)化研究了γ-zein和z-eolin基因在洋蔥表皮細(xì)胞和煙草中的表達(dá)情況，并驗證所構(gòu)建植物表達(dá)載體的正確性，為研究三葉草、紫花苜蓿等豆科牧草營養(yǎng)品質(zhì)改良奠定了良好的基礎(chǔ)。所以利用GFP檢測營養(yǎng)成分的分布和含量將成為分析飼料原料改良效果的有力工具。

3.4 水生環(huán)境檢測

人類的生產(chǎn)、生活活動對環(huán)境的影響逐漸增強(qiáng)，環(huán)境日益受到來自生產(chǎn)、生活的廢棄物的污染，水質(zhì)的污染就是一個較為嚴(yán)重的問題，污染物大多是來自工業(yè)廢物和污水。被污染的水質(zhì)對魚體的影響通常表現(xiàn)出生殖機(jī)能障礙、雄性魚體雌性化等。目前，人們已經(jīng)將生物作為生物傳感器的敏感元件來檢測污染水平。因為大多數(shù)生物傳感器只特異性對特定的化合物作用，而且在試驗過程中需要較多工作量和資金，所以人們正在尋求更簡單有效的方法。研究發(fā)現(xiàn)可通過將GFP基因重組到可與水中污染物發(fā)生反應(yīng)的啟動子中。這些啟動子是源于一些誘導(dǎo)基因:雌激素或異種雌激素誘導(dǎo)的雌激素效應(yīng)原件基因;編碼由應(yīng)激、重金屬或化學(xué)毒素誘導(dǎo)的熱應(yīng)激蛋白或金屬硫蛋白基因;有致癌物的腫瘤標(biāo)記基因等。有研究表明，GFP作為報告基因能夠被用來作為轉(zhuǎn)基因有機(jī)體連續(xù)的定性生物傳感器測定水中污染物的水平，并在消除酶或特異性蛋白質(zhì)試驗時，提供快速而有效的結(jié)果［27］。

3.5 酶活測定

Malik等［28］發(fā)現(xiàn)利用eGFP作為底物，通過測定熒光強(qiáng)度可以測定豬的胃蛋白酶的活性。這種方法有助于準(zhǔn)確、直觀測定動物腸道內(nèi)容物消化酶的體外消化能力。

3.6 營養(yǎng)代謝研究

礦物質(zhì)元素——鐵是動物和人健康生長不可或缺的。鐵不僅僅是血紅蛋白和肌紅蛋白的原料，而且還作為多種酶的成分和激活劑參與機(jī)體內(nèi)的物質(zhì)代謝。所以研究分析鐵離子在細(xì)胞內(nèi)的代謝狀態(tài)將有助于確定飼料中的鐵添加量以及探討鐵離子作為營養(yǎng)元素的分子作用機(jī)制。Henderson等［29］通過將鐵離子反應(yīng)原件(iron responsive element，IRE)重組到GFP質(zhì)粒中，發(fā)現(xiàn)可以檢測活細(xì)胞中鐵離子調(diào)節(jié)蛋白(iron regulatory protein，IRP)的活力，確定鐵離子在細(xì)胞內(nèi)的狀態(tài)。例如:如果細(xì)胞內(nèi)的鐵離子的濃度減少了，那么細(xì)胞內(nèi)的熒光蛋白的含量就減少了，說明IRP結(jié)合到了IRE上，并阻斷了蛋白質(zhì)翻譯。這為準(zhǔn)確分析外源及內(nèi)源刺激對鐵離子代謝的影響提供了動態(tài)檢測技術(shù)。

此外，GFP還被用于時空檢測分析磷脂酰纖維醇的代謝與細(xì)胞內(nèi)的鈣離子的水平的相關(guān)性［30］、維生素 E轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對維生素 E的轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)［31］、高氯酸鹽在甲狀腺細(xì)胞中的累積［32］以及測定胰島素樣生長因子Ⅰ［33］、游離脂肪酸的含量［34］等。GFP在代謝方面的推廣應(yīng)用必然帶動動物分子營養(yǎng)學(xué)的研究?，F(xiàn)代成像系統(tǒng)的完善將為動物營養(yǎng)分子代謝的研究提供有力的工具。熒光蛋白基因?qū)⒆鳛閳蟾婊驅(qū)⒃趧游餇I養(yǎng)成分代謝、酶類活性測定、蛋白質(zhì)分子動態(tài)檢測等方面呈現(xiàn)出巨大的優(yōu)勢。

4 小結(jié)

熒光蛋白使得變幻無窮的大自然生物現(xiàn)象可視化，這無疑是一大奇跡。熒光蛋白可用于時空監(jiān)控生物體內(nèi)的各種生物現(xiàn)象，例如基因表達(dá)、蛋白質(zhì)定位和動力學(xué)、細(xì)胞分化、染色體復(fù)制和調(diào)控、細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)途徑等，因此它成為了當(dāng)代生物科學(xué)研究中最重要的工具之一。現(xiàn)在科學(xué)家們?nèi)栽诶^續(xù)尋找新的熒光蛋白基因，使得被熒光蛋白標(biāo)記的蛋白質(zhì)不僅可以發(fā)綠光、黃光、橙光，還可以發(fā)紅光。眾多的熒光蛋白基因的構(gòu)建，以及基因表達(dá)技術(shù)的開發(fā)應(yīng)用，必然會給分子生物學(xué)研究注入新活力，給動物營養(yǎng)及其相關(guān)領(lǐng)域的研究帶來新氣象。

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