屠偉峰，鄧麗珍，馬亞平，尹晴，楊學(xué)敏，康旭，聶濤（.廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院麻醉科/全軍臨床麻醉中心，廣州 5000；.深圳翰宇藥業(yè)股份有限公司/多肽藥物國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，廣東深圳 58057）

神經(jīng)病理性疼痛是由外傷、腫瘤和感染等各種原因引起的神經(jīng)損傷，主要表現(xiàn)在損傷愈合后數(shù)周甚至數(shù)年依然存在疼痛超敏和自發(fā)性疼痛等痛覺異常，使得患者痛苦不堪，甚至喪失勞動(dòng)能力。近來研究發(fā)現(xiàn)，N型鈣離子通道阻滯藥齊考諾肽（Ziconotide，ZIC）可產(chǎn)生顯著抗神經(jīng)病理性疼痛的作用，其強(qiáng)度是嗎啡的300倍，且長(zhǎng)時(shí)間使用該藥不會(huì)產(chǎn)生耐受性和成癮性[1-2]，為頑固性神經(jīng)病理性疼痛、癌性疼痛的治療帶來了新希望。但由于進(jìn)口齊考諾肽是直接從芋螺毒素中提取，其成本過高，使得此藥在國內(nèi)臨床的應(yīng)用受到極大的限制。為此，深圳翰宇藥業(yè)股份有限公司采用化學(xué)合成法自主研發(fā)出了該產(chǎn)品。但由于其所采取的合成工藝和配合制劑不同，可能造成其鎮(zhèn)痛藥效不同，故本研究以進(jìn)口齊考諾肽注射液為對(duì)照，考察了國產(chǎn)齊考諾肽注射液對(duì)大鼠腰5脊神經(jīng)病理性疼痛的抑制作用，為臨床試驗(yàn)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Von Frey Kit觸覺測(cè)量套件及其工作臺(tái)（意大利Ugo Basile公司）。

1.2 藥品與試劑

齊考諾肽注射液（深圳翰宇藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：ZIC-2011030101，規(guī)格：100μg/ml），齊考諾肽注射液（以色列Elan公司，批號(hào)：49191PRN2，規(guī)格：100μg/ml），兩種制劑的劑量、外包裝和保存條件完全相同，根據(jù)需要用0.9%的氯化鈉溶液（生理鹽水）稀釋成相應(yīng)濃度的溶液；水合氯醛（天津市百世化工有限公司，批號(hào)：20101025，規(guī)格：每瓶100g）。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠，♂，體質(zhì)量180～220g，由南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心和廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證編號(hào)：SCXK（粵）2006-0015。分籠飼養(yǎng)，自由飲食，室溫23～26℃，相對(duì)濕度為55%～65%，白天黑夜各12h循環(huán)照明。

2 方法

2.1 建模與鞘內(nèi)置管

采用經(jīng)典的腰5脊神經(jīng)結(jié)扎加切斷術(shù)建立神經(jīng)病理性疼痛模型，并進(jìn)行鞘內(nèi)置管。具體步驟如下：取大鼠，10%水合氯醛0.35～0.4ml/100g腹腔麻醉后，備皮、消毒，分離左側(cè)腰5脊神經(jīng)，結(jié)扎后切斷；再于腰5與腰6脊正中間隙置入長(zhǎng)約10cm的PE-10導(dǎo)管，見有清亮腦脊液流出即可；逐層縫合切口，待大鼠蘇醒后，單籠喂養(yǎng)。

2.2 分組與給藥

參考國外經(jīng)典文獻(xiàn)[3]及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行相應(yīng)劑量分組，于建模手術(shù)后7d（記為7d）將建模成功的大鼠隨機(jī)分為7組，每組8只。模型組鞘內(nèi)注射生理鹽水20μl；國產(chǎn)齊考諾肽低、中、高劑量組鞘內(nèi)注射國產(chǎn)齊考諾肽注射液，劑量分別為每只30、100、300ng；進(jìn)口齊考諾肽低、中、高劑量組鞘內(nèi)注射進(jìn)口齊考諾肽注射液，劑量分別為每只30、100、300ng，鞘內(nèi)注射總體積均為每只20μl。

2.3 行為學(xué)測(cè)試

各組大鼠建模手術(shù)前3、1d（記為－3d、－1d）及建模手術(shù)后4、6d（記為4d、6d）需進(jìn)行50%機(jī)械性撤足閾值（PWT）的測(cè)定；并于建模手術(shù)后3、8d（記為3d、8d）進(jìn)行鞘內(nèi)導(dǎo)管利多卡因測(cè)試，確保給藥時(shí)導(dǎo)管位置的正確性及數(shù)據(jù)的可靠性；建模手術(shù)后7d鞘內(nèi)給藥，監(jiān)測(cè)各組大鼠給藥前1h（記為－1h）及給藥后1、2、4、8h的50%PWT。

2.4 50%PWT的測(cè)定

待各組大鼠安靜后，采用Up-Down方法[4]檢測(cè)大鼠不同時(shí)間點(diǎn)的50%PWT。選8根強(qiáng)度呈對(duì)數(shù)遞增方式的Von Frey纖維絲（0.41、0.70、1.20、2.04、3.63、5.50、8.51、15.14g）分別對(duì)大鼠后肢左右腳足心部進(jìn)行機(jī)械性刺激，每次刺激持續(xù)時(shí)間為6～8s。以2.041g為初始刺激強(qiáng)度，若撤足反應(yīng)為陰性則選用刺激強(qiáng)度遞增的相鄰Von Frey纖維絲繼續(xù)刺激；若撤足反應(yīng)為陽性則選用刺激強(qiáng)度遞減的相鄰Von Frey纖維絲繼續(xù)刺激。如此反復(fù)，以第一個(gè)轉(zhuǎn)折點(diǎn)的前一點(diǎn)為起點(diǎn)，連續(xù)6次的刺激結(jié)果為最終的撤足反應(yīng)模式。根據(jù)公式計(jì)算50%PWT（g）＝10（Xf+kδ）/10000，式中Xf為最末次測(cè)試Von Frey 纖維絲的對(duì)數(shù)值；k可根據(jù)撤足反應(yīng)模式查表[4]得出；δ為8根Von Frey纖維絲間對(duì)數(shù)差值的均值。另根據(jù)公式計(jì)算最大效應(yīng)百分比（MPE，%），用以評(píng)價(jià)抗神經(jīng)病理性疼痛的效果，MPE＝（給藥后撤足閾值－基礎(chǔ)撤足閾值）/（15g－基礎(chǔ)撤足閾值）×100%，其中撤足閾值即為50%PWT，基礎(chǔ)撤足閾值為－1d的50%PWT[5]。

2.5 利多卡因測(cè)試

經(jīng)已置入的鞘內(nèi)導(dǎo)管給予2%利多卡因10μl，再用10μl生理鹽水沖管，封閉導(dǎo)管外口，觀察給藥后大鼠雙下肢的運(yùn)動(dòng)情況。如在30s內(nèi)出現(xiàn)雙下肢麻痹無法運(yùn)動(dòng)，則可認(rèn)為置入的導(dǎo)管內(nèi)口位于蛛網(wǎng)膜下腔，表明置管成功。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

運(yùn)用SPSS 1310統(tǒng)計(jì)軟件，采用秩和檢驗(yàn)和單因素方差分析方法，所有數(shù)據(jù)以±s表示。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)50%PWT的變化見圖1，各組大鼠給藥后不同時(shí)間點(diǎn)MPE的變化見表1。

圖1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)50%PWT的變化與模型組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與同劑量進(jìn)口齊考諾肽組比較：△P＜0.01Fig 1 Changes of 50%PWT in each group at different time pointsvs.model group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.imported Ziconotide injection at same dose：△P＜0.01

結(jié)果表明，每只大鼠鞘內(nèi)單次注射進(jìn)口齊考諾肽注射液或國產(chǎn)齊考諾肽注射液30、100、300ng均可劑量依賴性地抑制大鼠神經(jīng)病理性疼痛超敏反應(yīng)，給藥后1h內(nèi)50%PWT達(dá)最高值，并在該水平左右可維持4h。與模型組比較，國產(chǎn)和進(jìn)口齊考諾肽低、中、高劑量組大鼠給藥后各時(shí)間點(diǎn)的50%PWT、MPE均明顯增加（P＜0.01），且呈明顯量效關(guān)系；與同劑量的進(jìn)口齊考諾肽組比較，國產(chǎn)齊考諾肽中、高劑量組大鼠給藥后1、2、4h的50%PWT、MPE差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。給藥后4h內(nèi)，國產(chǎn)齊考諾肽低、中、高劑量組大鼠的平均MPE分別為（47.83±15.16）%、（85.12±13.21）%、（99.11±2.53）%，表明中、高劑量組基本甚至完全抑制了模型大鼠的神經(jīng)病理性疼痛超敏反應(yīng)。

4 討論

表1 各組大鼠給藥后不同時(shí)間點(diǎn)MPE的變化（±s，n＝8）Tab 1 Changes of MPE in each group at different time points（±s，n＝8）

表1 各組大鼠給藥后不同時(shí)間點(diǎn)MPE的變化（±s，n＝8）Tab 1 Changes of MPE in each group at different time points（±s，n＝8）

與模型組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與同劑量進(jìn)口齊考諾肽組比較：△P＜0.01vs.model group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.imported Ziconotide injection at same dose：△P＜0.01

MPE，%組別模型組國產(chǎn)齊考諾肽低劑量組國產(chǎn)齊考諾肽中劑量組國產(chǎn)齊考諾肽高劑量組進(jìn)口齊考諾肽低劑量組進(jìn)口齊考諾肽中劑量組進(jìn)口齊考諾肽高劑量組1h 0.29±0.8646.65±18.52＊＊△88.18±14.23＊＊100.00±0.00＊＊26.65±11.61＊＊85.75±14.17＊＊100.00±0.00＊＊2h 0.42±0.2952.75±12.45＊＊△86.13±11.50＊＊100.00±0.00＊＊27.36±11.52＊＊82.77±16.67＊＊100.00±0.00＊＊4h 0.25±0.8044.09±14.50＊＊△81.06±13.91＊＊97.32±7.59＊＊18.75±7.83＊75.07±22.53＊＊96.09±3.91＊＊8h 0.36±0.8120.56±13.10＊40.83±22.66＊＊83.65±18.06＊＊7.51±5.5832.69±30.48＊＊79.58±22.18＊＊

N型鈣離子通道與慢性疼痛的形成密切相關(guān)，它主要分布于背根神經(jīng)細(xì)胞及脊髓背角神經(jīng)的突觸末梢，通過觸發(fā)谷氨酸及P物質(zhì)等神經(jīng)遞質(zhì)釋放，參與疼痛的傳遞與調(diào)控。齊考諾肽作為一種特異性N型鈣離子通道阻滯藥，其鎮(zhèn)痛機(jī)制主要是可逆性地阻滯N型鈣離子通道、調(diào)控疼痛介質(zhì)的釋放、阻斷疼痛信號(hào)的傳遞，從而緩解或抑制疼痛。目前其已被多個(gè)國家批準(zhǔn)用于治療各種術(shù)后疼痛、慢性疼痛、難治性疼痛，以及對(duì)阿片類藥物不敏感的疼痛[6]，其鞘內(nèi)注射較嗎啡更具潛力且不必?fù)?dān)心藥物的耐受性、成癮性及呼吸抑制。國外眾多專家更是認(rèn)為齊考諾肽與嗎啡聯(lián)合應(yīng)用是值得推薦的一種鎮(zhèn)痛方案[7]。

本研究結(jié)果顯示，國產(chǎn)和進(jìn)口齊考諾肽對(duì)神經(jīng)病理性疼痛模型大鼠有顯著的鎮(zhèn)痛作用。正常大鼠經(jīng)建模手術(shù)后50%PWT明顯下降，待建模手術(shù)后第7天神經(jīng)病理性疼痛形成后，單次鞘內(nèi)注射小劑量（每只30ng）國產(chǎn)和進(jìn)口齊考諾肽注射液便可有效對(duì)抗模型大鼠的神經(jīng)病理性疼痛，如按每只100、300ng劑量注射鎮(zhèn)痛效果更佳。因此可認(rèn)為，國產(chǎn)和進(jìn)口齊考諾肽對(duì)大鼠腰5脊神經(jīng)病理性疼痛均具有較好的鎮(zhèn)痛效應(yīng)。

[1] Schmidtko A，L?tsch J，F(xiàn)reynhagen R，et al.Ziconotide for treatment of severe chronic pain[J].Lancet，2010，375（9725）：1569.

[2] 史學(xué)蓮，劉小立.齊考諾肽（ziconotide）：一種非阿片類鎮(zhèn)痛藥物[J].實(shí)用疼痛學(xué)雜志，2010，6（4）：298.

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[5] Hama A，Sagen J.Antinociceptive effects of the marine snail peptides conantokin-G and conotoxin MVIIA alone and in combination in rat models of pain[J].Neuropharmacology，2009，56（2）：556.

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