高樹峰，張少容，徐蓮，李黎，萬俊，楊春平，劉建國(guó)，汪美群，劉月輝

喉癌是耳鼻咽喉頭頸外科常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率高，占?？茞盒阅[瘤的11%～22%，現(xiàn)手術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍是患者的主要死因[1]，因此尋找新的有效﹑簡(jiǎn)便﹑毒副作用小的治療方法成為耳鼻咽喉科工作者關(guān)注的焦點(diǎn)。CD47是細(xì)胞表面的重要標(biāo)記物；研究證實(shí)，在許多惡性腫瘤中均呈現(xiàn)過表達(dá)，而且其表達(dá)水平與疾病的預(yù)后呈明顯負(fù)相關(guān)[2-3]。本研究運(yùn)用慢病毒載體介導(dǎo)的RNAi干擾技術(shù)(RNA interference，RNAi)將針對(duì)CD47的特異性siRNA靶向慢病毒轉(zhuǎn)染喉癌Hep-2細(xì)胞，沉默CD47基因，檢測(cè)Hep-2細(xì)胞中CD47表達(dá)下調(diào)情況及其對(duì)喉癌細(xì)胞增殖﹑凋亡的影響，明確CD47基因表達(dá)水平與腫瘤生長(zhǎng)特性的關(guān)系。探討將CD47作為喉癌基因治療靶點(diǎn)的價(jià)值，為以后的臨床治療提供一定的實(shí)驗(yàn)參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 主要試劑：胎牛血清﹑1640培養(yǎng)液購自Hyclone公司(美國(guó))；LymphoprepTM分離液購自Nyco-Prep公司(挪威)；LipofectamineTMRNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司(美國(guó))；CD47抗體購自Abcam公司(英國(guó))；山羊抗兔IgG購自Southern Biotech公司(美國(guó))；兔抗鼠IgG購自武漢博士德生物工程有限公司(中國(guó))；RIPA裂解液購自北京碧云天公司(中國(guó))；HRP標(biāo)記的優(yōu)質(zhì)內(nèi)參購自上?？党缮锕?中國(guó))。主要儀器：細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱購自Thermo Scientific公司(英國(guó))；流式細(xì)胞儀購自BD FACSAria公司(美國(guó))；倒置熒光顯微鏡購自Leica公司(德國(guó))；定量PCR用SYBR Green qPCR SuperMix購自Invitrogen公司(美國(guó))。細(xì)胞系：人喉癌上皮細(xì)胞Hep-2購自中國(guó)科學(xué)院上海生化與細(xì)胞研究所；CD47siRNA慢病毒載體由Sigma公司(美國(guó))設(shè)計(jì)合成包裝。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) Hep-2細(xì)胞在10%的胎牛血清(含100U/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素)的1640培養(yǎng)液中生長(zhǎng)，并置于37℃，5%CO2的條件下培養(yǎng)，隔天換液1次，每4d傳代1次，一般傳代3～5次，當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.3 siRNA慢病毒轉(zhuǎn)染 取狀態(tài)良好的Hep-2細(xì)胞，用綠色熒光染料標(biāo)記后按5×104個(gè)/孔接種于6孔板，用無抗生素培養(yǎng)液培養(yǎng)24h，轉(zhuǎn)染組：待細(xì)胞融合度達(dá)底面積的40%～50%開始轉(zhuǎn)染，操作按照LipofectamineTMRNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑盒說明書要求進(jìn)行。將標(biāo)記后未轉(zhuǎn)染的Hep-2細(xì)胞作為空白對(duì)照組。將含有siRNA慢病毒的轉(zhuǎn)染試劑與細(xì)胞共孵育5h后加入新鮮培養(yǎng)液孵育，轉(zhuǎn)染后48h，棄培養(yǎng)基，每孔加入1μl Trizol，用定量PCR方法檢測(cè)siRNA慢病毒的干擾效率，并在倒置熒光顯微鏡下觀察兩組細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。

1.4 RT-PCR 以β-actin作為內(nèi)參照，設(shè)計(jì)引物序列為：CD47，正義5'-CTTTGAAGAGATGAGCAGT G-3'；反義5'-CGATGTGGGATCTAATTCTC-3'，擴(kuò)增片段265bp；β-actin，正義5'-TGGATCAGCAAGC AGGAGTA-3'；反義5'-TCGGCCACATTGTGAACTT T-3'，擴(kuò)增片段275bp。設(shè)25﹑50﹑100nmol/L梯度轉(zhuǎn)染組﹑對(duì)照組，分別標(biāo)記為：HEP2-01-25-CD47﹑HEP2-01-50-CD47﹑HEP2-01-100-CD47和HEP2-00-25-CD47(空白對(duì)照組)。樣品經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，行純度檢測(cè)無污染﹑完整性檢測(cè)總RNA抽提完整后，取總RNA 1.0μg于RNase free的PCR管中，加H2O至12μl，吹打均勻，置85℃保溫5min使RNA變性，置冰上防止RNA復(fù)性；續(xù)加Oligo(dT)0.5μl，反應(yīng)引物0.5μl，10mmol/L dNTP 2.0μl，RNase抑制劑0.5μl，5×buffer 4.0μl，M-MLV 0.5μl，將上述20μl反應(yīng)溶液30℃保溫10min；42℃保溫60min；85℃保溫10min。以(Oligo)dT為引物反轉(zhuǎn)錄合成cRNA第一鏈后，取5μl cRNA為模板，加入上下游引物各0.5μl，2×SYBR Green qPCR Super Mix 10μl，dH2O 4.0μl加至20μl后在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上擴(kuò)增。反應(yīng)條件：50℃ 2min，95℃2min，95℃ 15s，60℃ 32s，共40個(gè)循環(huán)。然后采用凝膠成像分析儀攝像，并分析計(jì)算siRNA的抑制效率。ΔCT=(Target gene CT－Reference CT)±SD；ΔΔCT=(Target gene ΔCT－Reference ΔCT)±SD；IE=(NX2–ΔΔCT－N2–ΔΔCT)/NX2–ΔΔCT×100%。NX為目的基因，N為參照基因。

1.5 Western blotting檢測(cè) 根據(jù)細(xì)胞量加入相應(yīng)RIPA裂解液，常規(guī)提取細(xì)胞蛋白，BCA法行蛋白初步定量。實(shí)驗(yàn)設(shè)HEP2組﹑NC組﹑CD47siRNAHEP2組。取樣品50μg，與上樣緩沖液按2:1混合，沸水浴5min，經(jīng)SDS-PAGE 電泳(80V恒壓50min，120V恒壓出現(xiàn)溴酚藍(lán)剛出膠底部止)﹑轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉TBST溶液封閉1h，一抗(兔抗鼠CD47稀釋倍數(shù)為1:4000)4℃過夜﹑二抗(兔抗鼠IgG稀釋倍數(shù)為1:2000)37℃孵育1h，TBST液洗滌5min×3次，在濕潤(rùn)的雜交膜表面上均勻加入發(fā)光液，反應(yīng)5min，濾紙吸凈多余底物溶液后暗盒曝光﹑顯影﹑定影。同時(shí)設(shè)置梯度實(shí)驗(yàn)，以β-actin為內(nèi)參照，應(yīng)用圖像分析軟件進(jìn)行圖像掃描分析蛋白表達(dá)情況，計(jì)算表達(dá)抑制率等。

1.6 細(xì)胞增殖測(cè)定 細(xì)胞轉(zhuǎn)染慢病毒48h后，均勻接種于96孔培養(yǎng)板中，加入MTT 10μl(5mg/ml)，恒溫培養(yǎng)箱孵育4h后，棄上清，每孔加入100μl DMSO溶解結(jié)晶30min，酶聯(lián)儀580nmol/L處測(cè)定吸光度(A)值，以正常細(xì)胞組存活率為100%，計(jì)算實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞存活率；同樣，轉(zhuǎn)染組設(shè)濃度(25﹑50﹑100nmol/L)梯度對(duì)比，最佳濃度設(shè)時(shí)間梯度(24﹑48﹑72h)進(jìn)行對(duì)比。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 慢病毒轉(zhuǎn)染的Hep-2細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 轉(zhuǎn)染后用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)：空白對(duì)照組喉癌細(xì)胞株Hep-2生長(zhǎng)良好，細(xì)胞形態(tài)未見明顯的改變，綠色熒光均勻分布。轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞密度相對(duì)減低，并可見細(xì)胞變形﹑皺縮，見貼壁數(shù)量相對(duì)減少，并見有圓而小的凋亡細(xì)胞，綠色熒光分布不均勻(圖1)。

2.2 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果 HEP2-01-25-CD47﹑HEP2-01-50-CD47和HEP2-01-100-CD47的mRNA表達(dá)抑制率分別為0.82﹑0.73﹑0.76。結(jié)果表明：CD47-siRNA慢病毒轉(zhuǎn)染對(duì)Hep-2細(xì)胞mRNA表達(dá)有明顯抑制作用，抑制率明顯高于HEP2-00-25-CD47(空白對(duì)照組)(t=5.28，P＜0.05)，且HEP2-01-25-CD47﹑HEP2-01-50-CD47和HEP2-01-100-CD47組間CD47-mRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=79.26，P＜0.05)，其中HEP2-01-25-CD47組CD47基因有較高的抑制率，沉默效果較好(表1)。

圖1 慢病毒轉(zhuǎn)染的Hep-2細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察Fig.1 Morphology of Hep 2 cells transfected by lentivirus

2.3 Western blotting檢測(cè)結(jié)果 Hep-2細(xì)胞轉(zhuǎn)染CD47-siRNA慢病毒48h后，分別提取HEP2組﹑NC組﹑CD47-siRNA-HEP2組細(xì)胞蛋白并檢測(cè)細(xì)胞CD47蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示：與HEP組相比較，CD47-siRNA慢病毒對(duì)目的基因有顯著的沉默效應(yīng)(圖2)。轉(zhuǎn)染組CD47蛋白表達(dá)明顯下降。對(duì)其灰度分析顯示，對(duì)目的基因進(jìn)行干擾后CD47的表達(dá)可下調(diào)77%。HEP2-01-25-CD47﹑HEP2-01-50-CD47和HEP2-01-100-CD47蛋白表達(dá)抑制率分別為78.19±3.31﹑76.95±2.68及69.76±2.12。其中25nmol/L濃度轉(zhuǎn)染組最明顯。不同濃度siRNA慢病毒實(shí)驗(yàn)組，CD47蛋白表達(dá)抑制率與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.4 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果 測(cè)定樣品細(xì)胞的增殖率顯示，轉(zhuǎn)染細(xì)胞在48h后細(xì)胞增殖下降明顯，為對(duì)照組的69%左右。NC組細(xì)胞存活率98%；G1期細(xì)胞存活率81%，S期細(xì)胞存活率74%；G2期細(xì)胞存活率69%，其中NC組與對(duì)照組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。A值在NC組與對(duì)照組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。另外，對(duì)Hep-2細(xì)胞轉(zhuǎn)染不同濃度(25﹑50﹑100nmol/L)CD47-siRNA慢病毒，觀察結(jié)果顯示隨著轉(zhuǎn)染濃度的增加，并不存在抑制效率隨濃度增加而增強(qiáng)的效應(yīng)。而轉(zhuǎn)染CD47-siRNA慢病毒(25nmol/L)24﹑48﹑72h后觀察Hep-2細(xì)胞增殖情況，結(jié)果顯示抑制效率隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 各樣品的CT值及抑制效率Tab.1 CT value and inhibition efficiency about different samples

圖2 Western blotting檢測(cè)各組中CD47蛋白的表達(dá)Fig.2 CD47 protein expression in each group detected by Western blotting

3 討 論

CD47最初是在人胎盤與整合素αVβ3共純化及從血小板與β3整合素免疫共沉淀過程中被人們所認(rèn)識(shí)，是一種廣泛分布于多種細(xì)胞表面上高度糖化的跨膜蛋白，屬于免疫球蛋白超家族的一員；CD47是細(xì)胞表面至關(guān)重要的標(biāo)記物，由特定的整聯(lián)蛋白﹑G蛋白及膽固醇組成的超分子復(fù)合物，其功能與整合素相關(guān)。與其互為受體配體的抑制性受體信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白α(signal regulatory protein-α，SIRPα)可形成CD47-SIRPα信號(hào)復(fù)合體，共同調(diào)節(jié)效應(yīng)細(xì)胞的功能及其所分泌的細(xì)胞因子，在誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫耐受﹑活化﹑細(xì)胞凋亡﹑巨噬細(xì)胞吞噬和腫瘤免疫治療等方面發(fā)揮多種調(diào)節(jié)作用[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)體存在兩套信號(hào)系統(tǒng)調(diào)控細(xì)胞，一套產(chǎn)生“別吃我”的信號(hào)，另一套產(chǎn)生“來吃我”的信號(hào)。CD47-SIRPα產(chǎn)生的抑制性作用就是“別吃我”類型的信號(hào)，而Fcγ受體或者其他促吞噬基因產(chǎn)生的促吞噬作用就是“來吃我”的信號(hào)，最終結(jié)果由兩種信號(hào)的相對(duì)強(qiáng)度所決定；大部分細(xì)胞凋亡時(shí)CD47表達(dá)量降低并被重新分配，凋亡細(xì)胞不再將SIRPα或下游的SHP-1激活[5]。近年來，斯坦福大學(xué)的研究者通過體外實(shí)驗(yàn)將單核巨噬細(xì)胞與用單克隆抗體封閉CD47的腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞凋亡被吞噬，為探究靶向治療惡性腫瘤奠定了基礎(chǔ)[6-8]。在自身免疫性溶血性貧血(AIHA)研究中發(fā)現(xiàn)CD47－的非肥胖糖尿病(NOD)大鼠發(fā)生輕度溶血，而CD47+的NOD大鼠在短時(shí)間內(nèi)均發(fā)生了致死性AIHA，表明CD47在AIHA發(fā)病中起到很大作用[9]。Olsson等[10]通過利用CD47缺乏的紅細(xì)胞(CD47－RBC)與CD47表達(dá)正常的紅細(xì)胞(CD47+RBC)比較，發(fā)現(xiàn)主要由脾髓巨噬細(xì)胞參與的對(duì)CD47－RBC的清除率遠(yuǎn)高于CD47+RBC，同時(shí)檢測(cè)到有大量SIRPα蛋白表達(dá)，表明CD47和SIRPα均參與了紅細(xì)胞吞噬過程的調(diào)節(jié)。深入研究發(fā)現(xiàn)，宿主靶細(xì)胞(如RBC)接受CD47呈遞來的信號(hào)，介導(dǎo)抑制性信號(hào)從而實(shí)現(xiàn)其對(duì)吞噬作用的調(diào)節(jié)[4]。Majeti等[11]發(fā)現(xiàn)在人類急性髓系白血病干細(xì)胞(AML LSC)上過表達(dá)的CD47通過與吞噬細(xì)胞上抑制性受體的相互作用來抑制它們的吞噬作用。此外，他們還發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組較正常對(duì)照組CD47在AML LSC上有更高的表達(dá)，這種CD47的過表達(dá)在3個(gè)獨(dú)立的不同實(shí)驗(yàn)組AML患者中預(yù)示著更差的總體生存率；應(yīng)用單克隆抗體封閉CD47后可優(yōu)先啟用AML LSC吞噬功能并抑制它們的體內(nèi)定植，同時(shí)治愈了大部分的非霍奇金淋巴瘤(NHL)小鼠，展示了CD47在疾病治療方面的前景。

近年來，慢病毒在醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究領(lǐng)域中已作為一個(gè)有效的基因轉(zhuǎn)移工具得以運(yùn)用，與其他載體相比，慢病毒更具優(yōu)勢(shì)[12-14]：首先，它既可轉(zhuǎn)染有絲分裂期的細(xì)胞，又可轉(zhuǎn)染分裂緩慢及處于分裂終末期的細(xì)胞；其次，載體穩(wěn)定﹑持久﹑高效，發(fā)生突變和畸形的概率小，可使轉(zhuǎn)基因細(xì)胞保持一個(gè)持久﹑穩(wěn)定的表達(dá)，更適合長(zhǎng)期誘導(dǎo)轉(zhuǎn)移目的基因序列的需要，且被拆分為三或四質(zhì)粒系統(tǒng)可大大提高其生物安全性；再次，慢病毒具有能夠容納相對(duì)大的轉(zhuǎn)移基因序列，并且具有免疫反應(yīng)小等優(yōu)點(diǎn)。因此，其應(yīng)用范圍越來越廣泛。

本研究針對(duì)CD47的RNA干擾片段及其慢病毒表達(dá)的載體，植入Hep-2后持續(xù)表達(dá)siRNA特異高效地靶向封閉目的基因，轉(zhuǎn)染72h后，從形態(tài)學(xué)上發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞熒光分布不均﹑貼壁數(shù)量相對(duì)減少，細(xì)胞變形，并可見凋亡等。RT-PCR和Western blotting檢測(cè)顯示，CD47-mRNA和蛋白的表達(dá)水平顯著降低，且有明顯的濃度依賴性，而非靶向的β-actin表達(dá)無影響，這說明了CD47 siRNA基因靶點(diǎn)篩選的有效性和干擾作用的特異高效性；MTT結(jié)果表明轉(zhuǎn)染CD47-siRNA慢病毒組Hep-2細(xì)胞的增殖能力受到明顯抑制，細(xì)胞存活率呈下降趨勢(shì)，說明通過下調(diào)CD47基因的表達(dá)，Hep-2細(xì)胞出現(xiàn)明顯凋亡，這進(jìn)一步證實(shí)下調(diào)CD47基因的表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖﹑誘導(dǎo)凋亡；同時(shí)，時(shí)間梯度實(shí)驗(yàn)中顯示抑制效率與時(shí)間呈正相關(guān)；轉(zhuǎn)染靶向CD47 siRNA慢病毒的濃度梯度實(shí)驗(yàn)中，在mRNA和蛋白水平上出現(xiàn)了抑制的差異性，說明存在著一個(gè)最佳轉(zhuǎn)染濃度，該濃度在本實(shí)驗(yàn)為25nmol/L?？傊?，本實(shí)驗(yàn)通過使用轉(zhuǎn)染靶向CD47基因的siRNA慢病毒，不僅有效下調(diào)了Hep-2中CD47基因的表達(dá)，同時(shí)初步證實(shí)轉(zhuǎn)染后的Hep-2具有明顯抑瘤活性，細(xì)胞存活率下降。但因腫瘤發(fā)病及發(fā)展的相關(guān)因素較多，CD47能否真正成為喉癌臨床治療的有效靶點(diǎn)，還需進(jìn)一步的深入研究。

[1] Lu X, Zhang SX, Yuan HY, et al. Expression and clinical significance of FADD in carcinoma of larynx[J]. Acta Acad Med CPAPF, 2010, 19(10): 761-763. [盧曦, 張淑香, 原紅艷, 等.FADD在喉癌的表達(dá)及臨床意義[J]. 武警醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2010,19(10): 761-763.]

[2] Jaiswal S, Jamieson CH, Pang WW, et al. CD47 is upregulated on circulating hematopoietic stem cells and leukemia cells to avoid phagocytosis[J]. Cell, 2009, 138(2): 271-285.

[3] Pettersen RD, Hestdal K, Olafsen MK, et al. CD47 signals T cell death[J]. J Immunol, 1999, 162(12): 7031-7040.

[4] Carani L, Sollazzo D, Ricci F, et al. The CD47 pathway is deregulated in human immune thrombocytopenia[J]. Exp Hematol, 2011, 39(4): 486-494.

[5] Olsson M, Nilsson A, Oldenborg PA. Target cell CD47 regulates macrophage activation and erythrophagocytosis[J]. Transfus Clin Biol, 2006, 13(1-2): 39-43.

[6] Chan KS, Volkmer JP, Weissman I. Cancer stem cells in bladder cancer: a revisited and evolving concept[J]. Curr Opin Urol,2010, 20(5): 393-397.

[7] Chao MP, Alizadeh AA, Tang C, et al. Anti-CD47 antibody synergizes with rituximab to promote phagocytosis and eradicate non-Hodgkin lymphoma[J]. Cell, 2010, 142(5): 699-713.

[8] Willingham SB, Volkmer JP, Gentles AJ, et al. The CD47-signal regulatory protein alpha (SIRPα) interaction is a therapeutic target for human solid tumors[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2012,109(17): 6662-6667.

[9] Oldenborg PA, Gresham HD, Chen Y, et al. Lethal autoimmune hemolytic anemia in CD47-deficient nonobese diabetic (NOD)mice[J]. Blood, 2009, 99(12): 3500-3504.

[10] Olsson M, Oldenborg PA. CD47 on experimentally senescent murine RBCs inhibits phagocytosis following Fcgamma receptormediated but not scavenger receptor-mediated recognition by macrophages[J]. Blood, 2008, 112(10): 4259-4267.

[11] Majeti R, Chao MP, Alizadeh AA, et al. CD47 is an adverse prognostic factor and therapeutic antibody target on human acute myeloid leukemia stem cells[J]. Cell, 2009, 138(2): 286-299.

[12] Wen KM, Fu ZX, Zhang GH, et al. Apoptosis induced by Octamer 4 gene silencing and its potential mechanism in colorectal cancer[J]. Med J Chin PLA, 2012, 37(10): 947-950.[文坤明, 傅仲學(xué), 張貴海, 等. Oct4基因沉默對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用及機(jī)制研究[J]. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志, 2012,37(10): 947-950.]

[13] Pfeifer A, Hofmann A. Lentiviral transgenesis[J].MethodsMol Biol, 2009, 530(1): 391-405.

[14] Zhu XX, Li XN, Guo Y, et al. Silencing effect of lentivirusmediated RNA interference on metastasis-associated gene 1(MTA1) in human nasopharyngeal carcinoma cell line[J]. Med J Chin PLA, 2010, 35(7): 853-856. [朱曉霞, 李學(xué)農(nóng), 郭煜, 等.慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾對(duì)鼻咽癌細(xì)胞株中轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1的沉默效應(yīng)[J]. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志, 2010, 35(7): 853-856.]