高樹峰，張少容，徐蓮，李黎，萬俊，楊春平，劉建國，汪美群，劉月輝

喉癌是耳鼻咽喉頭頸外科常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率高，占專科惡性腫瘤的11%～22%，現(xiàn)手術(shù)后復發(fā)和轉(zhuǎn)移仍是患者的主要死因[1]，因此尋找新的有效﹑簡便﹑毒副作用小的治療方法成為耳鼻咽喉科工作者關(guān)注的焦點。CD47是細胞表面的重要標記物；研究證實，在許多惡性腫瘤中均呈現(xiàn)過表達，而且其表達水平與疾病的預后呈明顯負相關(guān)[2-3]。本研究運用慢病毒載體介導的RNAi干擾技術(shù)(RNA interference，RNAi)將針對CD47的特異性siRNA靶向慢病毒轉(zhuǎn)染喉癌Hep-2細胞，沉默CD47基因，檢測Hep-2細胞中CD47表達下調(diào)情況及其對喉癌細胞增殖﹑凋亡的影響，明確CD47基因表達水平與腫瘤生長特性的關(guān)系。探討將CD47作為喉癌基因治療靶點的價值，為以后的臨床治療提供一定的實驗參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 主要試劑：胎牛血清﹑1640培養(yǎng)液購自Hyclone公司(美國)；LymphoprepTM分離液購自Nyco-Prep公司(挪威)；LipofectamineTMRNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司(美國)；CD47抗體購自Abcam公司(英國)；山羊抗兔IgG購自Southern Biotech公司(美國)；兔抗鼠IgG購自武漢博士德生物工程有限公司(中國)；RIPA裂解液購自北京碧云天公司(中國)；HRP標記的優(yōu)質(zhì)內(nèi)參購自上?？党缮锕?中國)。主要儀器：細胞恒溫培養(yǎng)箱購自Thermo Scientific公司(英國)；流式細胞儀購自BD FACSAria公司(美國)；倒置熒光顯微鏡購自Leica公司(德國)；定量PCR用SYBR Green qPCR SuperMix購自Invitrogen公司(美國)。細胞系：人喉癌上皮細胞Hep-2購自中國科學院上海生化與細胞研究所；CD47siRNA慢病毒載體由Sigma公司(美國)設計合成包裝。

1.2 細胞培養(yǎng) Hep-2細胞在10%的胎牛血清(含100U/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素)的1640培養(yǎng)液中生長，并置于37℃，5%CO2的條件下培養(yǎng)，隔天換液1次，每4d傳代1次，一般傳代3～5次，當細胞處于對數(shù)生長期進行轉(zhuǎn)染。

1.3 siRNA慢病毒轉(zhuǎn)染 取狀態(tài)良好的Hep-2細胞，用綠色熒光染料標記后按5×104個/孔接種于6孔板，用無抗生素培養(yǎng)液培養(yǎng)24h，轉(zhuǎn)染組：待細胞融合度達底面積的40%～50%開始轉(zhuǎn)染，操作按照LipofectamineTMRNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑盒說明書要求進行。將標記后未轉(zhuǎn)染的Hep-2細胞作為空白對照組。將含有siRNA慢病毒的轉(zhuǎn)染試劑與細胞共孵育5h后加入新鮮培養(yǎng)液孵育，轉(zhuǎn)染后48h，棄培養(yǎng)基，每孔加入1μl Trizol，用定量PCR方法檢測siRNA慢病毒的干擾效率，并在倒置熒光顯微鏡下觀察兩組細胞的形態(tài)學變化。

1.4 RT-PCR 以β-actin作為內(nèi)參照，設計引物序列為：CD47，正義5'-CTTTGAAGAGATGAGCAGT G-3'；反義5'-CGATGTGGGATCTAATTCTC-3'，擴增片段265bp；β-actin，正義5'-TGGATCAGCAAGC AGGAGTA-3'；反義5'-TCGGCCACATTGTGAACTT T-3'，擴增片段275bp。設25﹑50﹑100nmol/L梯度轉(zhuǎn)染組﹑對照組，分別標記為：HEP2-01-25-CD47﹑HEP2-01-50-CD47﹑HEP2-01-100-CD47和HEP2-00-25-CD47(空白對照組)。樣品經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，行純度檢測無污染﹑完整性檢測總RNA抽提完整后，取總RNA 1.0μg于RNase free的PCR管中，加H2O至12μl，吹打均勻，置85℃保溫5min使RNA變性，置冰上防止RNA復性；續(xù)加Oligo(dT)0.5μl，反應引物0.5μl，10mmol/L dNTP 2.0μl，RNase抑制劑0.5μl，5×buffer 4.0μl，M-MLV 0.5μl，將上述20μl反應溶液30℃保溫10min；42℃保溫60min；85℃保溫10min。以(Oligo)dT為引物反轉(zhuǎn)錄合成cRNA第一鏈后，取5μl cRNA為模板，加入上下游引物各0.5μl，2×SYBR Green qPCR Super Mix 10μl，dH2O 4.0μl加至20μl后在實時熒光定量PCR儀上擴增。反應條件：50℃ 2min，95℃2min，95℃ 15s，60℃ 32s，共40個循環(huán)。然后采用凝膠成像分析儀攝像，并分析計算siRNA的抑制效率。ΔCT=(Target gene CT－Reference CT)±SD；ΔΔCT=(Target gene ΔCT－Reference ΔCT)±SD；IE=(NX2–ΔΔCT－N2–ΔΔCT)/NX2–ΔΔCT×100%。NX為目的基因，N為參照基因。

1.5 Western blotting檢測 根據(jù)細胞量加入相應RIPA裂解液，常規(guī)提取細胞蛋白，BCA法行蛋白初步定量。實驗設HEP2組﹑NC組﹑CD47siRNAHEP2組。取樣品50μg，與上樣緩沖液按2:1混合，沸水浴5min，經(jīng)SDS-PAGE 電泳(80V恒壓50min，120V恒壓出現(xiàn)溴酚藍剛出膠底部止)﹑轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉TBST溶液封閉1h，一抗(兔抗鼠CD47稀釋倍數(shù)為1:4000)4℃過夜﹑二抗(兔抗鼠IgG稀釋倍數(shù)為1:2000)37℃孵育1h，TBST液洗滌5min×3次，在濕潤的雜交膜表面上均勻加入發(fā)光液，反應5min，濾紙吸凈多余底物溶液后暗盒曝光﹑顯影﹑定影。同時設置梯度實驗，以β-actin為內(nèi)參照，應用圖像分析軟件進行圖像掃描分析蛋白表達情況，計算表達抑制率等。

1.6 細胞增殖測定 細胞轉(zhuǎn)染慢病毒48h后，均勻接種于96孔培養(yǎng)板中，加入MTT 10μl(5mg/ml)，恒溫培養(yǎng)箱孵育4h后，棄上清，每孔加入100μl DMSO溶解結(jié)晶30min，酶聯(lián)儀580nmol/L處測定吸光度(A)值，以正常細胞組存活率為100%，計算實驗組細胞存活率；同樣，轉(zhuǎn)染組設濃度(25﹑50﹑100nmol/L)梯度對比，最佳濃度設時間梯度(24﹑48﹑72h)進行對比。

1.7 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件進行處理，數(shù)據(jù)以±s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 慢病毒轉(zhuǎn)染的Hep-2細胞形態(tài)學觀察 轉(zhuǎn)染后用熒光顯微鏡觀察細胞形態(tài)：空白對照組喉癌細胞株Hep-2生長良好，細胞形態(tài)未見明顯的改變，綠色熒光均勻分布。轉(zhuǎn)染組的細胞密度相對減低，并可見細胞變形﹑皺縮，見貼壁數(shù)量相對減少，并見有圓而小的凋亡細胞，綠色熒光分布不均勻(圖1)。

2.2 RT-PCR檢測結(jié)果 HEP2-01-25-CD47﹑HEP2-01-50-CD47和HEP2-01-100-CD47的mRNA表達抑制率分別為0.82﹑0.73﹑0.76。結(jié)果表明：CD47-siRNA慢病毒轉(zhuǎn)染對Hep-2細胞mRNA表達有明顯抑制作用，抑制率明顯高于HEP2-00-25-CD47(空白對照組)(t=5.28，P＜0.05)，且HEP2-01-25-CD47﹑HEP2-01-50-CD47和HEP2-01-100-CD47組間CD47-mRNA表達差異有統(tǒng)計學意義(F=79.26，P＜0.05)，其中HEP2-01-25-CD47組CD47基因有較高的抑制率，沉默效果較好(表1)。

圖1 慢病毒轉(zhuǎn)染的Hep-2細胞形態(tài)學觀察Fig.1 Morphology of Hep 2 cells transfected by lentivirus

2.3 Western blotting檢測結(jié)果 Hep-2細胞轉(zhuǎn)染CD47-siRNA慢病毒48h后，分別提取HEP2組﹑NC組﹑CD47-siRNA-HEP2組細胞蛋白并檢測細胞CD47蛋白表達水平。結(jié)果顯示：與HEP組相比較，CD47-siRNA慢病毒對目的基因有顯著的沉默效應(圖2)。轉(zhuǎn)染組CD47蛋白表達明顯下降。對其灰度分析顯示，對目的基因進行干擾后CD47的表達可下調(diào)77%。HEP2-01-25-CD47﹑HEP2-01-50-CD47和HEP2-01-100-CD47蛋白表達抑制率分別為78.19±3.31﹑76.95±2.68及69.76±2.12。其中25nmol/L濃度轉(zhuǎn)染組最明顯。不同濃度siRNA慢病毒實驗組，CD47蛋白表達抑制率與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

2.4 MTT實驗結(jié)果 測定樣品細胞的增殖率顯示，轉(zhuǎn)染細胞在48h后細胞增殖下降明顯，為對照組的69%左右。NC組細胞存活率98%；G1期細胞存活率81%，S期細胞存活率74%；G2期細胞存活率69%，其中NC組與對照組之間比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。A值在NC組與對照組之間比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。另外，對Hep-2細胞轉(zhuǎn)染不同濃度(25﹑50﹑100nmol/L)CD47-siRNA慢病毒，觀察結(jié)果顯示隨著轉(zhuǎn)染濃度的增加，并不存在抑制效率隨濃度增加而增強的效應。而轉(zhuǎn)染CD47-siRNA慢病毒(25nmol/L)24﹑48﹑72h后觀察Hep-2細胞增殖情況，結(jié)果顯示抑制效率隨時間的延長而增強，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

表1 各樣品的CT值及抑制效率Tab.1 CT value and inhibition efficiency about different samples

圖2 Western blotting檢測各組中CD47蛋白的表達Fig.2 CD47 protein expression in each group detected by Western blotting

3 討 論

CD47最初是在人胎盤與整合素αVβ3共純化及從血小板與β3整合素免疫共沉淀過程中被人們所認識，是一種廣泛分布于多種細胞表面上高度糖化的跨膜蛋白，屬于免疫球蛋白超家族的一員；CD47是細胞表面至關(guān)重要的標記物，由特定的整聯(lián)蛋白﹑G蛋白及膽固醇組成的超分子復合物，其功能與整合素相關(guān)。與其互為受體配體的抑制性受體信號調(diào)節(jié)蛋白α(signal regulatory protein-α，SIRPα)可形成CD47-SIRPα信號復合體，共同調(diào)節(jié)效應細胞的功能及其所分泌的細胞因子，在誘導T細胞免疫耐受﹑活化﹑細胞凋亡﹑巨噬細胞吞噬和腫瘤免疫治療等方面發(fā)揮多種調(diào)節(jié)作用[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，機體存在兩套信號系統(tǒng)調(diào)控細胞，一套產(chǎn)生“別吃我”的信號，另一套產(chǎn)生“來吃我”的信號。CD47-SIRPα產(chǎn)生的抑制性作用就是“別吃我”類型的信號，而Fcγ受體或者其他促吞噬基因產(chǎn)生的促吞噬作用就是“來吃我”的信號，最終結(jié)果由兩種信號的相對強度所決定；大部分細胞凋亡時CD47表達量降低并被重新分配，凋亡細胞不再將SIRPα或下游的SHP-1激活[5]。近年來，斯坦福大學的研究者通過體外實驗將單核巨噬細胞與用單克隆抗體封閉CD47的腫瘤細胞共培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞凋亡被吞噬，為探究靶向治療惡性腫瘤奠定了基礎[6-8]。在自身免疫性溶血性貧血(AIHA)研究中發(fā)現(xiàn)CD47－的非肥胖糖尿病(NOD)大鼠發(fā)生輕度溶血，而CD47+的NOD大鼠在短時間內(nèi)均發(fā)生了致死性AIHA，表明CD47在AIHA發(fā)病中起到很大作用[9]。Olsson等[10]通過利用CD47缺乏的紅細胞(CD47－RBC)與CD47表達正常的紅細胞(CD47+RBC)比較，發(fā)現(xiàn)主要由脾髓巨噬細胞參與的對CD47－RBC的清除率遠高于CD47+RBC，同時檢測到有大量SIRPα蛋白表達，表明CD47和SIRPα均參與了紅細胞吞噬過程的調(diào)節(jié)。深入研究發(fā)現(xiàn)，宿主靶細胞(如RBC)接受CD47呈遞來的信號，介導抑制性信號從而實現(xiàn)其對吞噬作用的調(diào)節(jié)[4]。Majeti等[11]發(fā)現(xiàn)在人類急性髓系白血病干細胞(AML LSC)上過表達的CD47通過與吞噬細胞上抑制性受體的相互作用來抑制它們的吞噬作用。此外，他們還發(fā)現(xiàn)實驗組較正常對照組CD47在AML LSC上有更高的表達，這種CD47的過表達在3個獨立的不同實驗組AML患者中預示著更差的總體生存率；應用單克隆抗體封閉CD47后可優(yōu)先啟用AML LSC吞噬功能并抑制它們的體內(nèi)定植，同時治愈了大部分的非霍奇金淋巴瘤(NHL)小鼠，展示了CD47在疾病治療方面的前景。

近年來，慢病毒在醫(yī)學基礎研究領(lǐng)域中已作為一個有效的基因轉(zhuǎn)移工具得以運用，與其他載體相比，慢病毒更具優(yōu)勢[12-14]：首先，它既可轉(zhuǎn)染有絲分裂期的細胞，又可轉(zhuǎn)染分裂緩慢及處于分裂終末期的細胞；其次，載體穩(wěn)定﹑持久﹑高效，發(fā)生突變和畸形的概率小，可使轉(zhuǎn)基因細胞保持一個持久﹑穩(wěn)定的表達，更適合長期誘導轉(zhuǎn)移目的基因序列的需要，且被拆分為三或四質(zhì)粒系統(tǒng)可大大提高其生物安全性；再次，慢病毒具有能夠容納相對大的轉(zhuǎn)移基因序列，并且具有免疫反應小等優(yōu)點。因此，其應用范圍越來越廣泛。

本研究針對CD47的RNA干擾片段及其慢病毒表達的載體，植入Hep-2后持續(xù)表達siRNA特異高效地靶向封閉目的基因，轉(zhuǎn)染72h后，從形態(tài)學上發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后細胞熒光分布不均﹑貼壁數(shù)量相對減少，細胞變形，并可見凋亡等。RT-PCR和Western blotting檢測顯示，CD47-mRNA和蛋白的表達水平顯著降低，且有明顯的濃度依賴性，而非靶向的β-actin表達無影響，這說明了CD47 siRNA基因靶點篩選的有效性和干擾作用的特異高效性；MTT結(jié)果表明轉(zhuǎn)染CD47-siRNA慢病毒組Hep-2細胞的增殖能力受到明顯抑制，細胞存活率呈下降趨勢，說明通過下調(diào)CD47基因的表達，Hep-2細胞出現(xiàn)明顯凋亡，這進一步證實下調(diào)CD47基因的表達可抑制細胞增殖﹑誘導凋亡；同時，時間梯度實驗中顯示抑制效率與時間呈正相關(guān)；轉(zhuǎn)染靶向CD47 siRNA慢病毒的濃度梯度實驗中，在mRNA和蛋白水平上出現(xiàn)了抑制的差異性，說明存在著一個最佳轉(zhuǎn)染濃度，該濃度在本實驗為25nmol/L?？傊?，本實驗通過使用轉(zhuǎn)染靶向CD47基因的siRNA慢病毒，不僅有效下調(diào)了Hep-2中CD47基因的表達，同時初步證實轉(zhuǎn)染后的Hep-2具有明顯抑瘤活性，細胞存活率下降。但因腫瘤發(fā)病及發(fā)展的相關(guān)因素較多，CD47能否真正成為喉癌臨床治療的有效靶點，還需進一步的深入研究。

[1] Lu X, Zhang SX, Yuan HY, et al. Expression and clinical significance of FADD in carcinoma of larynx[J]. Acta Acad Med CPAPF, 2010, 19(10): 761-763. [盧曦, 張淑香, 原紅艷, 等.FADD在喉癌的表達及臨床意義[J]. 武警醫(yī)學院學報, 2010,19(10): 761-763.]

[2] Jaiswal S, Jamieson CH, Pang WW, et al. CD47 is upregulated on circulating hematopoietic stem cells and leukemia cells to avoid phagocytosis[J]. Cell, 2009, 138(2): 271-285.

[3] Pettersen RD, Hestdal K, Olafsen MK, et al. CD47 signals T cell death[J]. J Immunol, 1999, 162(12): 7031-7040.

[4] Carani L, Sollazzo D, Ricci F, et al. The CD47 pathway is deregulated in human immune thrombocytopenia[J]. Exp Hematol, 2011, 39(4): 486-494.

[5] Olsson M, Nilsson A, Oldenborg PA. Target cell CD47 regulates macrophage activation and erythrophagocytosis[J]. Transfus Clin Biol, 2006, 13(1-2): 39-43.

[6] Chan KS, Volkmer JP, Weissman I. Cancer stem cells in bladder cancer: a revisited and evolving concept[J]. Curr Opin Urol,2010, 20(5): 393-397.

[7] Chao MP, Alizadeh AA, Tang C, et al. Anti-CD47 antibody synergizes with rituximab to promote phagocytosis and eradicate non-Hodgkin lymphoma[J]. Cell, 2010, 142(5): 699-713.

[8] Willingham SB, Volkmer JP, Gentles AJ, et al. The CD47-signal regulatory protein alpha (SIRPα) interaction is a therapeutic target for human solid tumors[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2012,109(17): 6662-6667.

[9] Oldenborg PA, Gresham HD, Chen Y, et al. Lethal autoimmune hemolytic anemia in CD47-deficient nonobese diabetic (NOD)mice[J]. Blood, 2009, 99(12): 3500-3504.

[10] Olsson M, Oldenborg PA. CD47 on experimentally senescent murine RBCs inhibits phagocytosis following Fcgamma receptormediated but not scavenger receptor-mediated recognition by macrophages[J]. Blood, 2008, 112(10): 4259-4267.

[11] Majeti R, Chao MP, Alizadeh AA, et al. CD47 is an adverse prognostic factor and therapeutic antibody target on human acute myeloid leukemia stem cells[J]. Cell, 2009, 138(2): 286-299.

[12] Wen KM, Fu ZX, Zhang GH, et al. Apoptosis induced by Octamer 4 gene silencing and its potential mechanism in colorectal cancer[J]. Med J Chin PLA, 2012, 37(10): 947-950.[文坤明, 傅仲學, 張貴海, 等. Oct4基因沉默對結(jié)直腸癌細胞凋亡的誘導作用及機制研究[J]. 解放軍醫(yī)學雜志, 2012,37(10): 947-950.]

[13] Pfeifer A, Hofmann A. Lentiviral transgenesis[J].MethodsMol Biol, 2009, 530(1): 391-405.

[14] Zhu XX, Li XN, Guo Y, et al. Silencing effect of lentivirusmediated RNA interference on metastasis-associated gene 1(MTA1) in human nasopharyngeal carcinoma cell line[J]. Med J Chin PLA, 2010, 35(7): 853-856. [朱曉霞, 李學農(nóng), 郭煜, 等.慢病毒介導的RNA干擾對鼻咽癌細胞株中轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1的沉默效應[J]. 解放軍醫(yī)學雜志, 2010, 35(7): 853-856.]