李瑾昱，張國慶，焦順昌，溫新宇，孫勝杰

西妥昔單抗(cetuximab，IMC-C225)是一種抗表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)的人/鼠嵌合型IgG1單克隆抗體，能夠以高出內(nèi)源配體5～10倍的親和力與EGFR特異結(jié)合，阻礙其與內(nèi)源性配體的結(jié)合，進而阻斷受體的二聚化﹑酪氨酸激酶磷酸化及下游一系列信號轉(zhuǎn)導，阻斷受體功能。K-ras是EGFR信號通路下游的小分子G蛋白，K-ras基因點突變可導致該信號通路處于持續(xù)激活狀態(tài)，不受EGFR上游信號指令的影響[1-2]。研究表明，西妥昔單抗對K-ras基因野生型結(jié)直腸癌患者的治療效果好于突變型[3-4]，然而在非小細胞肺癌患者中進行的研究表明，雖然與單純化療相比，聯(lián)合西妥昔單抗能延長患者的總生存期[5-6]，但治療獲益與K-ras基因突變狀態(tài)無關(guān)[5-10]。因此推測西妥昔單抗對K-ras基因突變的非小細胞肺癌可能存在其他作用機制。本研究以文獻報道的K-ras基因突變的非小細胞肺癌A549細胞作為靶細胞[11-12]，觀察西妥昔單抗對該細胞的效應及基因表達譜的變化，探討西妥昔單抗對非小細胞肺癌的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑 HERA Safe KS-12型生物安全柜﹑HERA Cell 240型CO2細胞培養(yǎng)箱﹑SORVALL LEGEND MACH 1.6R離心機﹑Multiskan MK3酶標儀(Thermo公司，美國)；Olympus BX41正置顯微鏡﹑Olympus CKX41倒置顯微鏡(Olympus公司，日本)；流式細胞儀(Beckman公司，美國)；Veriti 96孔梯度PCR儀(Applied Biosystems公司，美國)。西妥昔單抗注射液(默克公司，德國)；RPMI 1640培養(yǎng)基﹑無菌PBS﹑胎牛血清(Gibco公司，美國)；胰蛋白酶-EDTA消化液(Amresco公司，美國)；Cell Counting Kit-8(Dojindo Laboratories公司，日本)；Annexin V-FITC細胞凋亡試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)；Blood & Cell Culture DNA Mini Kit(Qiagen公司，德國)；2×Taq PCR MasterMix Kit(北京博邁德科技有限公司)；Trizol試劑盒(Invitrogen公司，美國)；RNA Clean-up試劑盒(MACHEREY-NAGEL公司，德國)；RT-PCR試劑盒(北京晶美生物有限公司)；人腫瘤相關(guān)基因芯片﹑cRNA擴增標記試劑盒(北京博奧生物公司)。

1.2 方法

1.2.1 靶細胞制備 人肺腺癌A549細胞由本室常規(guī)凍存并復蘇，細胞用RPMI 1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清﹑100U/ml青霉素﹑100U/ml鏈霉素)于37℃﹑5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞制成懸液，加20g/L臺盼藍染液混勻，細胞計數(shù)板計數(shù)活細胞。

1.2.2 西妥昔單抗對A549細胞生長的抑制作用將對數(shù)生長期的A549細胞接種于96孔板，每孔5×103個細胞(100μl)，37℃﹑5%CO2培養(yǎng)箱孵育12h，待其完全貼壁后，實驗組加入西妥昔單抗(終濃度0.045mg/ml)，對照組加入等體積生理鹽水，兩組均設(shè)3個復孔。于37℃﹑5%CO2培養(yǎng)箱分別孵育24﹑48h后，每孔加入CCK-8試劑10μl，2h后用酶標儀于450nm處測定吸光度(A)值，結(jié)果取均值，重復3次。

1.2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡 將對數(shù)生長期A549細胞接種于6孔板，每孔5×105個細胞(2ml)，37℃﹑5%CO2培養(yǎng)箱孵育12h，待其完全貼壁后，實驗組加入西妥昔單抗(終濃度0.045mg/ml)，對照組加入等體積生理鹽水。于37℃﹑5%CO2培養(yǎng)箱分別孵育24﹑48h后將兩組細胞用胰酶消化，PBS洗滌2次，1500r/min離心5min，棄上清。加入500μl Binding Buffer混懸細胞，再加入5μl Annexin V-FITC混勻，最后加入5μl Propidium Iodide混勻，室溫避光反應15min，流式細胞儀檢測，分析各組細胞凋亡率。

1.2.4 基因芯片制備與檢測 ①將對數(shù)生長期A549細胞接種于6孔板，每孔2×105個細胞(2ml)，37℃﹑5%CO2培養(yǎng)箱孵育12h，待其完全貼壁后，實驗組加入西妥昔單抗(終濃度0.045mg/ml)，對照組加入等體積生理鹽水。于37℃﹑5%CO2培養(yǎng)箱孵育48h后抽提細胞總RNA并檢測純度。②對樣品RNA進行熒光標記。③雜交﹑清洗與芯片掃描：RNA標記后溶于80μl雜交液(3×SSC﹑0.2%SDS﹑5×Denhart's﹑25%甲酰胺)中42℃雜交過夜。雜交結(jié)束后，先在42℃含0.2%SDS，2×SSC的液體中洗5min，然后在0.2×SSC中室溫洗5min。玻片甩干后用Luxscan 10KA雙通道激光掃描儀進行掃描。采用Luxscan 3.0圖像分析軟件對芯片圖像進行分析并篩選差異表達基因，以灰度值比值相差2倍以上作為差異具有顯著性的標準。采用SAM軟件進行分析，錯誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate，F(xiàn)DR)控制在5%以內(nèi)。

1.2.5 Real-time PCR檢測 ①DNA酶消化基因組DNA；②總RNA純化；③1.5%非變性瓊脂糖凝膠電泳驗證總RNA消化效果；④將樣品總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA；⑤Real-time PCR反應；⑥數(shù)據(jù)處理：利用儀器所配軟件計算各張PCR芯片中每個基因?qū)崟r熒光強度顯著大于背景值時的循環(huán)數(shù)值，采用2-ΔΔCt方法比較相應基因表達量的變化。

圖1 西妥昔單抗對A549細胞的生長抑制作用(n=3)Fig. 1 Effect of cetuximab on proliferation inhibition of A549 cells (n=3)

2 結(jié) 果

2.1 西妥昔單抗對A549細胞的生長抑制作用CCK-8法檢測結(jié)果顯示，將西妥昔單抗分別作用于A549細胞24﹑48h，間接反映活細胞數(shù)目的A值低于照組，差異有統(tǒng)計學意義意義(P＜0.05，圖1)，表明西妥昔單抗對A549細胞的生長具有抑制作用。

2.2 西妥昔單抗對A549細胞的凋亡誘導作用西妥昔單抗作用24h后，K-ras基因突變的A549細胞凋亡率為12.43%±2.08%，而作用48h后凋亡率為23.20%±1.78%，與對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義，且兩個時間點比較差異也有統(tǒng)計學意義(P＜0.01，圖2)。

圖2 西妥昔單抗對A549細胞的凋亡誘導作用Fig.2 Derivation eff ect of cetuximab on apoptosis of A549 cells

2.3 基因芯片掃描結(jié)果 與對照組相比，實驗組細胞中有10個基因表達顯著上調(diào)，9個基因表達顯著下調(diào)(表1﹑2)。此外，一些具有重要功能的基因表達變化雖然未達到2倍以上，但也有顯著改變，如胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-3(IGFBP3)基因表達上調(diào)1.96倍，p27KIP1基因表達上調(diào)1.89倍。

2.4 Real-time PCR檢測結(jié)果 STAT1基因參與細胞的凋亡誘導過程，因此選取STAT1基因?qū)π酒Y(jié)果進行驗證。此外，基因芯片結(jié)果顯示，IGFBP3基因表達上調(diào)1.96倍，由于其具有重要抑癌作用，因此，本研究也利用Real-time PCR對其表達水平進行驗證。以GAPDH作為內(nèi)參，以各基因的差異比除以內(nèi)參值，對各基因的差異比進行歸一化。結(jié)果顯示STAT1和IGFBP3基因歸一化后的差異比分別為1.5和1.74，基因芯片得到的差異比為2.07和1.96。兩種檢測結(jié)果都表明STAT1和IGFBP3基因表達上調(diào)。

表1 西妥昔單抗作用后A549細胞中表達上調(diào)的基因Tab.1 Upregulated genes of A549 by cetuximab

表2 西妥昔單抗作用后A549細胞中表達下調(diào)的基因Tab.2 Downregulated genes of A549 by cetuximab

3 討 論

西妥昔單抗是一種抗EGFR的人/鼠嵌合型IgG1單克隆抗體，可顯著延長晚期非小細胞肺癌患者的中位生存期﹑1年生存率及總生存期[6-7]。2009年西妥昔單抗被納入NCCN指南并推薦作為晚期非小細胞肺癌患者的一線治療藥物。西妥昔單抗對K-ras基因野生型結(jié)直腸癌的治療效果優(yōu)于突變型[3-4,11]，而對非小細胞肺癌的療效與K-ras基因突變狀態(tài)無關(guān)[9]，表明其對K-ras基因突變的非小細胞肺癌同樣具有抗腫瘤作用。本研究從細胞水平探討西妥昔單抗對非小細胞肺癌的抗腫瘤作用及其機制。

本研究首先將西妥昔單抗作用于A549細胞24h及48h，采用CCK-8法檢測藥物對細胞的毒性，結(jié)果顯示，與對照組相比，西妥昔單抗對A549細胞具有顯著的生長抑制作用，即對K-ras基因突變的非小細胞肺癌具有體外抗腫瘤作用。既往研究表明，K-ras基因突變的腫瘤細胞無需EGFR配體與受體的結(jié)合就能使EGFR通路自身磷酸化，從而激活下游信號通路，引起腫瘤細胞增殖。因此理論上即使西妥昔單抗阻斷了EGFR與配體的結(jié)合，也仍然不能阻止K-ras基因突變細胞EGFR信號通路的活化，不能發(fā)揮抗腫瘤作用。然而無論臨床試驗還是細胞學實驗結(jié)果均表明西妥昔單抗對K-ras基因突變的非小細胞肺癌具有抗腫瘤作用，因此西妥昔單抗可能還存在其他抗腫瘤機制。

本研究檢測了西妥昔單抗作用24及48h后A549細胞的凋亡情況，結(jié)果表明西妥昔單抗能夠誘導A549細胞凋亡，這可能是其對非小細胞肺癌發(fā)揮抗腫瘤作用的機制之一?；蛐酒瑱z測顯示，與對照組比較，西妥昔單抗作用48h后A549細胞中有19個基因表達差異在2倍以上，其中10個基因表達顯著上調(diào)，9個基因表達顯著下調(diào)。這些差異表達的基因涉及腫瘤細胞生物學活性的很多方面，如細胞增殖﹑細胞周期﹑細胞耐藥等，其中介導細胞凋亡的STAT1基因[12]表達顯著上調(diào)，進一步采用Realtime PCR對基因芯片結(jié)果進行驗證也證實了這一點。STAT1介導細胞凋亡的主要環(huán)節(jié)可能是胞質(zhì)中STAT1激活并形成二聚體，進入細胞核促進相應靶基因轉(zhuǎn)錄，從而促進細胞凋亡，或者STAT1直接上調(diào)細胞質(zhì)中Caspase-3﹑7的表達水平，誘發(fā)細胞凋亡。此外，STAT1激活后還可通過上調(diào)p27KIP1的表達使細胞停滯在G1期[13-14]。本研究的基因芯片結(jié)果也證實了西妥昔單抗作用后A549細胞的p27KIP1基因表達上調(diào)1.89倍。因此，西妥昔單抗作用后可能通過上調(diào)STAT1表達介導細胞凋亡及細胞周期阻滯從而對K-ras基因突變的A549細胞發(fā)揮抗腫瘤作用。

此外，基因芯片結(jié)果顯示IGFBP3基因表達水平上調(diào)1.96倍，Real-time PCR驗證也顯示其表達上調(diào)。IGFBP3可通過IGF依賴性和非依賴性兩種方式抑制腫瘤細胞的復制﹑生長﹑增殖和轉(zhuǎn)移。一方面IGFBP3通過競爭抑制IGF-1與其受體結(jié)合，可部分阻斷IGF-1的促腫瘤細胞有絲分裂及凋亡抑制效應[15]，另一方面IGFBP3可通過移位至細胞核而直接或間接地與核內(nèi)生長抑制基因和凋亡基因發(fā)生相互作用，從而影響細胞的基因表達，具有促凋亡作用[16-17]。此外，IGFBP3還能有效地阻止尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA)和基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)刺激的侵襲途徑，最終抑制肺癌細胞的轉(zhuǎn)移[18]。IGFBP3作為最主要的IGFs結(jié)合蛋白，其表達水平升高可對肺癌的發(fā)生和惡性轉(zhuǎn)化產(chǎn)生明顯的抑制作用。皮佳俐等[19]的研究提示IGFBP3對體外培養(yǎng)的肺腺癌細胞株A549及肺鱗癌細胞株NCL-H520具有明顯的增殖抑制作用且呈一定的劑量依賴性。因此，上調(diào)IGFBP3表達也可能是西妥昔單抗對K-ras基因突變的非小細胞肺癌發(fā)揮抑制作用的機制之一。

本研究在體外細胞水平證實了西妥昔單抗對K-ras基因突變的肺腺癌A549細胞具有生長抑制及凋亡誘導作用，與臨床研究中西妥昔單抗對K-ras基因突變的非小細胞肺癌有效的結(jié)果一致。此外，西妥昔單抗作用后A549細胞發(fā)生了一系列涉及細胞增殖﹑細胞周期﹑細胞耐藥等方面的基因表達改變，這些有可能與其作用機制相關(guān)，但仍有待進一步研究探討。

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