劉美蘭，譚曉風(fēng)，龍洪旭，張 琳，周俊琴，王建勇

(中南林業(yè)科技大學(xué) 經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410004)

油桐(Vernicia fordii)是我國南方重要的木本油料經(jīng)濟(jì)樹種[1]。油桐的種子含油率高(50% ～70%)，它具有優(yōu)異的防水、絕緣、防腐蝕性能，是重要的工業(yè)油料，還可做燃料及生物柴油[2，3]。目前，國內(nèi)外對油桐的研究主要集中在栽培選優(yōu)及豐產(chǎn)林改造方面，分子水平的研究報(bào)道較少，龍洪旭等[4-5]對個(gè)別基因進(jìn)行了克隆，譚曉風(fēng)等[6]構(gòu)建了油桐種子EST文庫構(gòu)建。本文中以葡萄桐近成熟種子為材料，在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫的基礎(chǔ)上，開展對油桐優(yōu)質(zhì)基因資源的分離克隆研究，為油脂合成進(jìn)行遺傳改良提供資源和技術(shù)基礎(chǔ)。

β-酮脂酰-ACP還原酶(KAR)又名β-氧脂酰-ACP還原酶，，催化乙酰乙酰-ACP還原成β-羥脂酰-ACP，該酶的天然底物是乙酰乙酰-ACP，但同時(shí)也能利用?；鵆oA和?；腚装?。在Ⅱ型脂肪酸合成途徑中，KAR是唯一催化酮脂酰還原反應(yīng)的酶[7-8]。根據(jù)與NADH不同的作用方式，植物β-酮脂酰-ACP還原酶分2種等位形式:一種是依賴NADPH的酶，已從油菜、大麥葉、菠菜葉，紅花種子、眼蟲和鱷梨中果皮中克隆出來，其中從油菜、鱷梨中分離的還原酶是NADHP特異的，它的N-端有細(xì)胞色素f結(jié)構(gòu)域，內(nèi)部還有1個(gè)類似NodG基因的產(chǎn)物，其編碼基因已從擬南芥、油菜中克隆，它的N-端編碼區(qū)編碼1個(gè)可將多肽定位于質(zhì)體基質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)肽[9-10]。另一種是與NADH相聯(lián)結(jié)的酶，催化β-酮脂酰-ACP還原，已從鱷梨中果皮的質(zhì)體和眼蟲純化，至于在脂肪酸合成中的作用尚不清楚。Klein等[11]的雜交研究表明，在披針葉萼距花(CwpAea lanceolata)中β-酮脂酰-ACP還原酶由一個(gè)至少有兩個(gè)基因的小基因家族編碼，并且這個(gè)家庭的成員在根、葉、花和種子中都表達(dá)。兩種等位形式的β-酮脂酰-ACP還原酶共同控制脂肪酸合成的第一個(gè)還原反應(yīng)，對脂肪酸合成有極其重要的作用。因此，油桐KAR基因的克隆與生物學(xué)信息分析將為進(jìn)一步調(diào)控油桐脂肪酸生物合成提供物質(zhì)基礎(chǔ)，并為油桐KAR基因的利用提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料 2012年8月底在湖南省永順縣青坪鎮(zhèn)中南林業(yè)科技大學(xué)油桐試驗(yàn)基地，即國家油桐種質(zhì)資源保存庫采集葡萄桐近成熟種子為實(shí)驗(yàn)材料，保存于-80℃冰箱中備用。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 實(shí)驗(yàn)所有試劑名稱和來源如下表1。

表1 實(shí)驗(yàn)試劑名稱和來源Tab.1 Experimental reagents name and origin

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA的提取和cDNA的合成 采用Invitrogen公司的PureLinkTMRNA Mini Kit試劑盒、CTAB裂解和氯仿/異戊醇抽提的綜合方法提取油桐種子內(nèi)的總RNA。使用10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的提取效果。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)根據(jù)TaKaRa公司cDNA合成試劑盒說明書完成，從而得到第一條鏈cDNA，以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.2.2 油桐KAR基因的克隆 從油桐種子轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果中獲得KAR1和KAR2的全長序列，它們的開放閱讀框長分別為993 bp和900 bp。依據(jù)2條Unigene序列利用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)引物(表2)，以葡萄桐近成熟種子反轉(zhuǎn)錄的單鏈cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系及引物序列如表3。回收PCR產(chǎn)物并連入pEASY-Blunt Simple載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞，在含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上進(jìn)行陽性篩選，選擇陽性克隆送北京六合華大基因公司測序。將獲得的基因序列分別命名為Vf_KAR1和Vf_KAR2。

表2 油桐KAR全長引物序列Tab.2 Primer sequence of Vernicia fordii KAR

表3 油桐KAR全長擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系和反程序列Tab.3 PCR amplification reaction and response procedures of Vernicia fordii KAR

1.2.3 生物信息學(xué)分析 通過 NCBI進(jìn)行在線BLASTX分析，對克隆基因進(jìn)行功能確定;用在線多工具Clustalw2、Vector NTI 10.3.0和GENDOC軟件進(jìn)行同源性分析，并用軟件MEGA5.1構(gòu)建Neighborjoining系統(tǒng)進(jìn)化樹;利用在線軟件ProtParam、SignalP4.1和TargetP 1.1 Server對編碼蛋白分別進(jìn)行了理化性質(zhì)分析、信號肽和導(dǎo)肽性分析;采用在線ProtScale、TMpred Server和Mobyle portal分別進(jìn)行編碼蛋白的疏水性、跨膜結(jié)構(gòu)和跨膜區(qū)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)預(yù)測;同時(shí)，利用在線工具SOPMA和EsyPred3Dwebserver1.0分別進(jìn)行二維結(jié)構(gòu)和三維結(jié)構(gòu)的預(yù)測，并利用本地軟件UCSF Chimera對三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 油桐Vf_KAR1和Vf_KAR2基因的克隆與序列分析

根據(jù)測序結(jié)果比對分析，Vf_KAR1(Unigene1369_All)全長為1 449 bp(圖1-A)，其中5'UTR長為128 bp，3'UTR長為328 bp，CDS長為993 bp，推測其編碼331個(gè)氨基酸;Vf_KAR2(Unigene9987_All)全長為1 086 bp(圖1-B)，其中5'UTR長為17 bp，3'UTR長為3 bp，CDS長為900 bp，推測其編碼300個(gè)氨基酸。將Vf_KAR1和Vf_KAR2進(jìn)行BLASTX分析后共搜索到100多條相似度很高的KAR同源序列，因此可以判斷Vf_KAR1和Vf_KAR2的CDS均為β-酮脂酰-ACP還原酶(KAR)基因。

圖1 油桐KAR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplification results of Vernicia fordii KAR

利用在線工具Clustalw2將推導(dǎo)出的Vf_KAR1和Vf_KAR2氨基酸序列與其他物種的KAR氨基酸進(jìn)行多重序列比對分析，結(jié)果顯示這些基因所編碼的氨基酸序列具有較高的相似性，各物種之間的同源性在62% ～82%，油桐Vf_KAR1和Vf_KAR2相似性僅有74%，Vf_KAR1與蓖麻的相似度最高，達(dá)82%;Vf_KAR2基因與花生、辣椒的相似度高達(dá)76%。通過GENDOC軟件序列比對和在線Predictprotein序列分析結(jié)果還顯示，各物種所編碼的氨基酸都存在高度保守的“Ser-tyr-Lys”三聯(lián)體催化中心(圖2羅馬數(shù)字Ⅲ)，這是短鏈脫氫還原酶家族的主要特征之一。同時(shí)，在氨基酸序列中存較多的?；稽c(diǎn)，此外還有糖基化位點(diǎn)、蛋白激酶C和酪蛋白激酶介導(dǎo)的磷酸化位點(diǎn)(圖2)。用軟件MEGA5.1構(gòu)建進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)Vf_KAR1與蓖麻處于同一進(jìn)化枝上，進(jìn)化關(guān)系最為接近，Vf_KAR2找不到與其同一進(jìn)化枝的植物(圖3)。

圖2 不同物種KAR氨基酸序列比對結(jié)果Fig.2 Amino acid sequences alignment of KAR from different species

圖3 不同物種KAR種系進(jìn)化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of KARs from different species

2.2 油桐Vf_KAR1和Vf_KAR2基因編碼蛋白的理化性質(zhì)分析

利用在線ProtParam對Vf_KAR1和Vf_KAR2基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行了理化性質(zhì)分析，結(jié)果表明:Vf_KAR1和Vf_KAR2所形成的蛋白分子量分別為35 kD和32 kD;等電點(diǎn)為9.28和9.11;理論推導(dǎo)半衰期都為30 h;編碼蛋白的原子組成分別為C1536H2506N432O466S13和C1410H2289N393O421S13;不穩(wěn)定系數(shù)是33.52和32.12，由此說明這兩個(gè)蛋白是穩(wěn)定性蛋白;脂肪系數(shù)為93.72和95.93，總平均親水性分別為0.095和0.108，說明這兩個(gè)蛋白的疏水性較弱。

2.3 信號肽和導(dǎo)肽的預(yù)測和分析

信號肽(signal peptide)常位于蛋白N端，由可被剪切的15～30個(gè)氨基酸的前導(dǎo)序列組成。當(dāng)被轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白質(zhì)肽鏈的合成在mRNA起始密碼上啟動后，首先合成帶有信號肽的蛋白，信號肽被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的受體蛋白所識別并相互結(jié)合，此時(shí)受體蛋白可聚合而產(chǎn)生膜內(nèi)通道，信號肽引導(dǎo)蛋白經(jīng)過通道進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，隨后信號肽被膜內(nèi)側(cè)的信號肽酶水解，蛋白質(zhì)隨之變?yōu)槌墒斓鞍踪|(zhì)。導(dǎo)肽又稱轉(zhuǎn)運(yùn)肽(transit peptide)或?qū)蛐蛄?targeting sequence)，它是游離核糖體上合成的新生蛋白N端長約20～80個(gè)氨基酸殘基的肽鏈，通常為帶正電荷的堿性氨基酸，精氨酸和賴氨酸含量較為豐富，具有引導(dǎo)附著序列進(jìn)入線粒體或葉綠體靶位點(diǎn)的功能，因此導(dǎo)肽的預(yù)測和分析對研究蛋白質(zhì)的定位具有重要作用[12]。利用SignalP4.1對油桐Vf_KAR1和Vf_KAR2基因的氨基酸序列進(jìn)行在線信號肽預(yù)測，綜合各項(xiàng)指標(biāo)表明兩條序列都不含信號肽。使用在線TargetP 1.1 Server分析油桐Vf_KAR1和Vf_KAR2基因的氨基酸序列導(dǎo)肽性，結(jié)果分析表明兩條序列都含有葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的RC值分別為1和5。RC是可靠性等級，是一個(gè)衡量最高和第二得分最高輸出之間的差異，較低的RC價(jià)值的預(yù)測更安全，因此，可推測油桐Vf_KAR1和Vf_KAR2都含有葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽。預(yù)測結(jié)果與報(bào)道的其他物種KAR基因((如油菜Brassicanopus)結(jié)構(gòu)一致[12]。

2.4 油桐Vf_KAR1和Vf_KAR2基因編碼蛋白的疏水性/親水性的預(yù)測和分析

氨基酸序列決定蛋白質(zhì)的功能，組成蛋白質(zhì)的20種氨基酸各具特殊的側(cè)鏈，當(dāng)它們按照不同的序列關(guān)系組合時(shí)，就可形成多種多樣的空間結(jié)構(gòu)，使其具有不同生物學(xué)活性。疏水性是20種氨基酸都固有的特性，是影響蛋白質(zhì)構(gòu)象的重要因素，因此蛋白質(zhì)疏水性/親水性的預(yù)測和分析，對預(yù)測蛋白質(zhì)生物學(xué)功能具有重要意義[13]。利用在線ProtScale分析預(yù)測Vf_KAR1和Vf_KAR2編碼蛋白的疏水性，參照其數(shù)字文本格式分析發(fā)現(xiàn)Vf_KAR1和Vf_KAR2分別有161個(gè)和150個(gè)疏水性氨基酸殘基，分別占各自總殘基數(shù)的49.8%和51.4%，編碼的氨基酸序列中親水性氨基酸、疏水性都均勻分布在各個(gè)肽鏈中，綜合Vf_KAR1和Vf_KAR2的脂肪系數(shù)與總平均親水性來分析，可推測Vf_KAR1和Vf_KAR2基因編碼的蛋白是疏水性蛋白，且Vf_KAR2比Vf_KAR1的疏水性較強(qiáng)。

2.5 Vf_KAR1和Vf_KAR2基因編碼蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)與拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)預(yù)測

利用在線TMpred Server和Mobyle portal對Vf_KAR1和Vf_KAR2進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)和跨膜區(qū)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果(圖4，圖5)顯示:Vf_KAR1僅有1個(gè)跨膜域和1個(gè)疑似跨膜域，Vf_KAR僅有2個(gè)疑似跨膜域。每個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域由20個(gè)氨基酸殘基組成的螺旋，同時(shí)兩條序列的跨膜蛋白N端和C端都位于細(xì)胞膜胞質(zhì)的同一側(cè)。

圖4 Vf_KAR1的跨膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.4 Predicted transmembrane topology of Vf_KAR1

圖5 Vf_KAR2的跨膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.5 Predicted transmembrane topology of Vf_KAR2

2.6 油桐Vf_KAR1和Vf_KAR2基因編碼蛋白二級結(jié)構(gòu)及三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測

利用在線工具SOPMA軟件預(yù)測Vf_KAR1和Vf_KAR2氨基酸序列的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示Vf_KAR1蛋白殘基組成為:α-螺旋(h)為40.79%、β-折疊(e)為21.75%、β-轉(zhuǎn)角(t)為9.97%、隨機(jī)卷曲(c)為27.49%;Vf_KAR2的 α-螺旋(h)為44.00%、β-折疊(e)為19.67%、β-轉(zhuǎn)角(t)為9.33%、無規(guī)卷曲(c)為27.00%。通過比較分析，Vf_KAR1和Vf_KAR2氨基酸序列的二級結(jié)構(gòu)較為相似。

根據(jù)PDBsum數(shù)據(jù)庫，對Vf_KAR1和Vf_KAR2三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫搜索已知的蛋白分子模板，結(jié)果顯示Vf_KAR1和Vf_KAR2與Brassica napus.Rape的晶體結(jié)構(gòu)(pDB:1edoA)最為相似，相似度達(dá)85.2%和81.07%，E-value=1.19e-107 和5.20e-104(圖 6)。

圖6 預(yù)測的Vf_KAR1和Vf_KAR2三級結(jié)構(gòu)模板Fig.6 Predicted tertiary structure template of Vf_KAR and Vf_KAR2

利用EsyPred3Dwebserver1.0在線軟件對Vf_KAR1和Vf_KAR2進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)預(yù)測，并利用本地軟件UCSF Chimera進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析顯示:Vf_KAR1和Vf_KAR2單體結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)典型的Rossmann折疊特征(如圖7)。預(yù)測的Vf_KAR1和Vf_KAR2單體三維結(jié)構(gòu)基本相似，它們都由10個(gè)α螺旋和7個(gè)β折疊組成，其中7個(gè)纏繞平行的β折疊分布于10個(gè)α螺旋的兩側(cè)，它們的結(jié)構(gòu)中心由兩個(gè)右手螺旋的βαβαβmotif組成。從疏水表面立體圖可以看到酶的整個(gè)輪廓(圖8)，其中橘黃色為α螺旋，占主要部分。這些結(jié)構(gòu)與β-酮脂酰-ACP還原酶發(fā)揮催化作用有著密切的關(guān)系。

圖7 Vf_KAR1和Vf_KAR2彩帶立體圖Fig.7 Ribbons stereogram of Vf_KAR1 and Vf_KAR2

圖8 Vf_KAR1和Vf_KAR2疏水表面立體圖Fig.8 Hydrophobic surface graphic model ofVf_KAR1 and Vf_KAR2

3 結(jié)論與討論

β-酮脂酰-ACP還原酶是唯一催化酮脂酰還原反應(yīng)的酶，在植物脂肪酸合成途徑中起著極其重要的作用，目前對植物β-酮脂酰-ACP還原酶基因的研究較少。本文根據(jù)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的油桐3個(gè)時(shí)期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，以葡萄桐近成熟種子為材料，擴(kuò)增克隆了2個(gè)β-酮脂酰-ACP還原酶基因，命名并在GenBank數(shù)據(jù)庫中登錄，分別為Vf_KAR1和Vf_KAR2。經(jīng)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)獲得的2個(gè)β-酮脂酰-ACP還原酶均無信號肽，但都有葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽;它們都為疏水性蛋白，都有典型的活化中心三聯(lián)體(Ser-Tyr-Lys);它們的三級結(jié)構(gòu)都有典型的Rossmann折疊特征;此外，它們的理化特性、拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)及其二級結(jié)構(gòu)也極相似，因此，推測Vf_KAR1和Vf_KAR2為油桐β-酮脂酰-ACP還原酶基因家族的兩個(gè)成員。β-酮脂酰-ACP還原酶基因在多種植物(B.rassican napus)[3]、細(xì)菌(M.tuberculosis等)[14-15]和頂復(fù)門原蟲(P.falciparum)[16]等生物中也發(fā)現(xiàn)了。它們都屬于短鏈脫氫還原酶(SDR)家族[17]，SDR家族的酶有一個(gè)相當(dāng)保守的α/β折疊，它以Rossman折疊的形式存在，此外它在催化必需的質(zhì)子傳遞系統(tǒng)中存在ser-Tyr-Lys三聯(lián)體活化位點(diǎn)，并且后期的結(jié)構(gòu)信息解析中也揭示了ser-Tyr-Lys三聯(lián)體活化位點(diǎn)對β-酮脂酰-ACP還原酶的功能是極其重要的[18]。但是油桐β-酮脂酰-ACP還原酶基因家族成員的數(shù)量以及各成員的具體功能仍然有待驗(yàn)證。下一步將繼續(xù)克隆β-酮脂酰-ACP還原酶基因家族的成員，利用真核表達(dá)、原核表達(dá)或RNA干擾技術(shù)，來分析該基因在油桐植物體內(nèi)的生理功能，這為進(jìn)一步研究油桐脂肪酸的生物合成與代謝調(diào)控提供了候選的基因資源。

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