楊君照 徐 凱 白 玉 劉金堯 王建玉

（1.江蘇省鹽城市阜寧縣東溝鎮(zhèn)人民政府，鹽城 224000；

2.江蘇省鹽城市農業(yè)委員會，鹽城 224000；

3.山西省大同市畜禽管理所，大同 037000；

4.江蘇省新沂市農業(yè)委員會，新沂 221400；

5.江蘇省連云港市灌云縣住建局，連云港 222000）

關于LAMP技術檢測禽白血病病毒J亞群的特異性及靈敏性的分析

楊君照1徐 凱2白 玉3劉金堯4王建玉5

（1.江蘇省鹽城市阜寧縣東溝鎮(zhèn)人民政府，鹽城 224000；

2.江蘇省鹽城市農業(yè)委員會，鹽城 224000；

3.山西省大同市畜禽管理所，大同 037000；

4.江蘇省新沂市農業(yè)委員會，新沂 221400；

5.江蘇省連云港市灌云縣住建局，連云港 222000）

環(huán)介導等溫擴增LAMP是一門新興的分子生物學檢測技術，由于其具有特異性高、敏感性高、簡單、快速、廉價、易檢測等特點，受到了生物醫(yī)學研究者的高度關注。本文旨在分析禽白血病病毒J亞群LAMP法檢測體系的特異性，并比較LAMP法與常規(guī)PCR法在檢測禽白血病病毒J亞群中的敏感性。結果顯示，在禽白血病病毒J亞群病毒中，無交叉反應；而靈敏性分析結果顯示，LAMP法在檢測ALV-J過程中其敏感性勝于常規(guī)PCR。

環(huán)介導等溫擴增 J亞群白血病 lk特異性 敏感性

禽白血病病毒 J 亞群（ALV-J）在我國及世界各國的禽病中影響越來越為廣泛，并且在我國形成一種蔓延的趨勢，它是一種以能誘導肉雞產生骨髓細胞瘤?。∕L）、腎瘤和其他多種腫瘤，死亡率為1%～2%，偶爾可高達20%的一種禽類疾病。而目前對此病的診斷方法主要是ELISA、PCR為主，但對實驗的條件及其人員要求相對較高，而環(huán)介導等溫擴增（LAMP）是由Notomi等人設計并用于鑒別病毒及其他病原體的一種新型檢測方法。本項技術主要是利用4種不同的特異性引物識別靶基因的6個特定區(qū)域和一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在等溫條件進行擴增反應基因的擴增和產物的檢測。其具有高效、靈敏、快速、方便等特點。本次實驗就該項技術對于ALV-J的靈敏性及特異性做了相關的研究。

1 試驗材料

1.1 材料

毒株：揚州大學秦愛建實驗室ALV-J JSNT株，山東農業(yè)大學崔治中實驗室ALV-JNX0101株，華南農業(yè)大學SCAU-0901，SCAU-CHN，RAV-1，RAV-2，ALV-A，ALV-B，ALV-E等10株。

1.2 主要儀器和設備

動物飼養(yǎng)設備，PCR儀，電泳儀，凝膠成像系統(tǒng)，離心機，水浴鍋，細胞培養(yǎng)箱，二氧化碳培養(yǎng)箱。

1.3 主要試劑

引物合成，蛋白酶K、PCR試劑，RNA提取試劑盒，消化液，5×TBE電泳緩沖液/L，54 gTris堿，27.5 g硼酸，20 ml EDTA（0.5M、pH8.0），室溫保存，使用時5倍稀釋。50×TAE電泳緩沖液/L：242 gTris堿，57.1 ml冰乙酸，100 ml EDTA（0.5M、pH8.0），室溫保存，使用時50倍稀釋。LAMP試劑，限制性內切酶，胎牛血清，Bst大片段鏈置換酶，SYBR green I dye，反轉錄酶M-Mulv、Rnase Inhibitor，隨機引物、DEPC處理水.

2 試驗方法與步驟

2.1 病毒核酸的提取

使用RNA提取試劑盒進行提取。

2.2 樣品制備

2.2.1 RNA反轉錄

50 ul體系（按照本實驗室經典體系進行反轉錄，參數(shù)如下）

2.2.2 反轉錄步驟

將提取的病毒核酸溶于DEPC處理過的DDW中，70℃反應5 min；拿出后立即冰水浴，稍離心，依次加入RNA酶抑制劑，反轉錄酶及其Buffer、dNTP、42 ℃反應1 h；拿出后95℃反應以滅活反轉錄酶活性，4 ℃保存，用于LAMP及PCR檢測。

2.3 引物設計及反應體系

2.3.1 引物設計

對于ALV-J通過專門的LAMP引物設計軟件Primer Explorer V3軟件（Eiken Chemical Co.Ltd.，Tokyo，Japan）的設計以及以及上海生物工程有限公司的合成。得到如下引物：

成果轉化服務人才隊伍建設方面存在的問題 科技成果轉化往往需要資金和市場，轉化需要包括技術研發(fā)、技術經紀、技術市場把握、與企業(yè)溝通談判等在內的團隊協(xié)同工作，從目前的情況分析來看，江蘇師范大學要不斷地加大比較熟悉市場且懂得相應技術的中介人才隊伍的建設，從而推動學校專利成果轉化。

2.3.2 反應體系

2.3.2.1 LAMP反應體系為25μl 1×ThermoPol buffer（New England BiolabsInc.，U SA），6mM Mg2+，0.8mM dNTPs，0.25μM外引物（F3和B3），1.0μM內引物（FIP和B IP），1μl模板DNA，8U Bst聚合酶（New England Biolabs），0.4M甜菜堿（Sigma-Aldrich Inc.，MO，USA），20 mM Tris-HCl，10mM KCl，10 mM（NH4）2SO4。反應條件：63℃恒溫45min，然后85℃恒溫5 min。

2.3.2.2 PCR反應體系為25 ul 10×擴增緩沖液2.5ul，1.5 ulM Mg2+，0.5 ul Taq DNA聚合酶，0.5 ul 模板DNA，引物各0.5 ul，2 ul MdNTP。

Method Primer name length Sequence（5’-3’）LAMP F3 19 GCAACCAGGGAACCTTTGG B3 20 GCTGACGAGACTAACCGATC FIP 38 AAGGGGAGGTGGCTGACTGTTTACATGGGCCGACCGTA BIP 40 ATCCCGTCCCCTATTTCCGAGGTTCCCAAGGTGGTGCAATT PCR H5 20 GGATGAGGTGACTAAGAAAG H7 20 GGAACCAAAGGTAACACACG

PCR反應循環(huán)參數(shù)：在95℃下5 min使得模板DNA變性，并在94℃下維持30 s。置于50℃下1 min，因為退火溫度越高，所得產物的特異性越高，延伸反應72℃維持40 s并做30輪的循環(huán)擴增。最后一輪循環(huán)結束后，于72℃下保溫10 min，使反應產物擴增充分，并且在16℃下保存。

2.4 特異性的試驗

2.4.1 LAMP擴增特異性及產物的檢測方法

用Dde Ⅰ內切酶確定LAMP擴增產物的特異性，酶切產物經過瓊脂凝膠電泳檢測：瓊脂糖濃度為2%，50×TAE電泳緩沖液/L，以恒定電壓120V電泳45 min，最后用紫外線燈檢測擴增條帶。

熒光檢測：產物中加SYBR GreenI，肉眼觀察顏色反應；呈綠色的為陽性反應，橙紅色為陰性反應。在紫外光照射下呈綠色熒光的為陽性反應，黃色為陰性反應。

2.4.2 ALV-J病毒LAMP檢測方法特異性

取ALV-J（JSNT、JNX0101、SCAU-0901、SCAU-CHN）、ALV-A、ALV-B、RAV-1、RAV-2、ALV-E1、ALV-E2為模板進行LAMP擴增，按照其體系進行檢測，分析其特異性。

2.5 敏感性的試驗

LAMP VS Conventional PCR

2.5.1 倍比稀釋比較

用10-1-10-9稀釋度的ALV-J病毒為模板分別進行LAMP、常規(guī)PCR，分析LAMP檢測靈敏性。

2.5.2 用質粒載體克隆方式比較

為了比較LAMP及常規(guī)PCR檢測反應的敏感性，將JSNT株中PCR擴增的545bp的特異性擴增片段進行純化，然后克隆至pGEM-T載體中，重組質粒放入LB培養(yǎng)液中，37℃搖床過夜培養(yǎng)。重組質粒DNA采用QIAprep Spin Miniprep試劑盒提?。≦IAGEN，CA，USA），進行序列驗證，陽性質粒采用260 nm紫外分光光度計定量，然后倍比稀釋用于兩種方法的敏感性比較。

3 試驗結果

試驗結果有3種判定方法：①瓊脂糖電泳后，用SYBR GreenI染色檢測。②產物中加入Mg2+試劑，肉眼觀測副產物焦磷酸鎂沉淀，產物呈陽性的反應，則管內液體渾濁，離心或由白色沉淀集于管底，陰性反應則無此現(xiàn)象。③產物中加SYBR GreenI，肉眼觀察顏色反應；呈綠色的為陽性反應，橙紅色為陰性反應；在紫外光照射下呈綠色熒光的為陽性反應，黃色為陰性反應。

3.1 LAMP在ALV-J基因檢測中的擴增特異性及產物檢測

分別用瓊脂糖凝膠電泳法、白色沉淀法和SYBR green I綠色熒光法檢測LAMP 擴增產物。用Dde Ⅰ內切酶確定其特異性，如圖2 B。LAMP擴增產物在凝膠電泳圖譜上呈梯狀（泳道1），經過內切酶消化，出現(xiàn)了200 bp，267 bp 或 314 bp三條泳帶（泳道2）與理論值相符合，說明是特異性的擴增。SYBR green I 熒光檢測中，一管為綠色（圖1 B），另一管為桔黃色（圖1 B），綠色表明結果為陽性，桔黃色為陰性。

圖1 白色沉淀法和SYBR green Ⅰ綠色熒光法

圖1A擴增產物中加入Mg2+試劑，左邊管有產物焦磷酸鎂沉淀，呈陽性反應，液體渾濁，離心或由白色沉淀集于管底，右側陰性反應則無此現(xiàn)象。B中產物中加SYBR GreenI，肉眼觀察顏色反應；呈綠色的為陽性反應，橙紅色為陰性反應。在紫外光照射下呈綠色熒光的為陽性反應，黃色為陰性反應。

3.2 ALV-J病毒ALMP檢測方法的特異性

以其他病毒為模板檢測體系的特異性，實驗結果如圖2A。具體檢測結果如附表；由此可知，ALV-J病毒LAMP檢測法只擴增ALV-J病毒核酸而不擴增其他非目標核酸，因此其建立的LAMP具有良好的檢測特異性。

圖2 禽白血病J亞型病毒檢測方法特異性

圖2A以ALV-J（JSNT、JSNT、SCAU-0901、SCAU-CHN）、ALV-A、ALV-B、RAV-1、RAV-2、ALV-E1、ALV-E2為模板進行LAMP擴增，ALV-J（NX0101、JSNT、SCAU-0901、SCAUCHN）出現(xiàn)擴增，其他病毒未出現(xiàn)擴增。圖2B擴增產物在凝膠電泳圖譜上呈梯狀（泳道1），經過內切酶消化，出現(xiàn)了200 bp，267 bp，or 314 bp三條泳帶（泳道2）

表 ALV-J與其他病毒特異性檢測結果

3.3 LAMP在ALV-J基因檢測中的靈敏度的測試

以10-1～10-9稀釋度的ALV-J病毒DNA為模板分別進行了LAMP、常規(guī) PCR，分析LAMP檢測靈敏性，結果如圖3。LAMP可以檢測到5個拷貝的核酸，如圖3。但是，ALV-J病毒在realtime PCR法只能檢測到102個拷貝的核酸。經過幾次試驗都得到了相似的結果。由此可見，所建立的ALV-J病毒LAMP檢測法較常規(guī) PCR靈敏性高。

圖3 LAMP及常規(guī)PCR的靈敏度的測試

圖3 LAMP可以檢測到5個拷貝的核酸，realtime PCR法能檢測到102個拷貝的核酸

4 討論及其分析

4.1 LAMP 特異性測試

LAMP之所以有很強的特異性，是因為四條特異性的引物可以識別靶基因當中的六個特異序列，從而使得LAMP擴增的高特異性。在LAMP產物檢測的3種方法當中，就LAMP擴增產物在瓊脂凝膠電泳圖譜上之所以呈梯狀，主要是由于擴增產物的左后產物為莖環(huán)DNA組成的混合物，也就是說其中有若干倍莖長度的類似花椰菜結構的莖環(huán)DNA。其次，DdeⅠ內切酶消化的這一結果表明了試驗的結果與理論預期是一致的，證明了LAMP擴增產物的特異性。LAMP核酸擴增當中，由于焦磷酸根離子與反應液中的Mg2+相結合從而產生了焦磷酸鎂白色沉淀，因此還可通過相關的濁度儀進行檢測，實現(xiàn)它的定量和實時監(jiān)測。如果LAMP有擴增產物，則向反應溶液中加入SYBR green I dye，SYBR green I就會與DNA相結合，可以當即用肉眼進行觀察，反應溶液為綠色則為陽性；反應溶液為橘黃色則為陰性。3種方法中，以綠色熒光檢測最為迅速，便捷，可靠，可以實現(xiàn)現(xiàn)場的快速檢測的需求。

4.2 LAMP 靈敏度測試

在試驗過程中，通過與普通PCR的比較，LAMP的高靈敏度，是由于擴增模板量可低至10拷貝或更少，而產物擴增指數(shù)達109～1010拷貝，因此其靈敏性相對較高。LAMP檢測方法具有很高的靈敏性，檢測極限相對較高，能夠很大程度上的實現(xiàn)現(xiàn)場快速初檢的需求。

4.3 綜合評價

就此次實驗而言，雖然LAMP的原理相對復雜，但是所建立的關于ALV-J病毒LAMP檢測體系，是一項可以在等溫條件下，具有快速、便捷、高效、靈敏的一項檢測技術，用于現(xiàn)場的快速檢測，無需復雜的儀器設備，對于人員要求也相對不高，是一個快速、便捷的新方法。當然，在本次試驗中還存在一些不足之處，比如特異性試驗中的毒株在實驗過程中由于各方面原因還差一些亞群不能獲得，造成了試驗的欠缺。其次LAMP技術并未與RT-PRC進行對比。然后，LAMP在臨床應用上還有待廣泛應用。LAMP是一種新型的核酸擴增方法，在某些方面可能仍然存在一些不足，例如Nagamine曾報道DNA 模板在不預變性的條件下也能發(fā)生LAMP 擴增，但其機制尚不清楚，如果這種現(xiàn)象的原因得以闡明，將進一步簡化LAMP 技術的操作程序。Maruyama曾報道不使用外引物也能產生特異性的階梯狀條帶。此外，LAMP 擴增的產物不易分析，在數(shù)篇文獻報道中LAMP 擴增的梯度性條帶的帶型存在差異。與此同時，引物設計難度大也是限制LAMP 技術推廣的因素。但是，相信隨著相關研究的不斷深入，將會使LAMP技術得到更好的發(fā)展及完善，從而能更好的服務于社會。

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