張紅見，鐵忠華，趙 靜，鐘耀安，沈得貴

（1. 青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海西寧 810016；2. 青海畜牧獸醫(yī)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，青海湟源 812100；3. 青海省動物疫病預(yù)防控制中心，青海西寧 810001）

犬細小病毒感染（Canine Parvovirus Infection，CPI）是由犬細小病毒（Canine Parvovirus，CPV）引起犬的一種以劇烈嘔吐、出血性腸炎、血性水樣便、脫水、白細胞顯著減少和心肌炎為特征的急性傳染病，幼齡犬多發(fā)[1]，且純種犬發(fā)病率比雜種犬、土種犬高。CPV首先由美國學(xué)者Eugster和Nairn于20世紀70年代從患出血性腸炎的犬糞便中分離獲得[2]。1982 年梁士哲在我國首次分離到該病毒，隨后各地均有大量報道[3-4]。作為當今世界大型犬原始祖先的藏獒是當今犬類中唯一沒有被時間和環(huán)境因素所改變的活化石，其基因庫中匯聚了世界犬種最優(yōu)良的性狀和性能基因，屬國家二級保護動物[5]。根據(jù)青海省農(nóng)牧業(yè)綜合區(qū)劃所1995年的調(diào)查統(tǒng)計，全省有藏獒9萬多只，而純種藏獒僅為600多只，且其種群品質(zhì)退化極為嚴重，處于瀕臨滅絕的地步。隨著國內(nèi)外藏獒協(xié)會影響力的逐年增大，特別是自2007年以來藏獒熱的持續(xù)升溫，純種藏獒已被賣到千萬天價。而內(nèi)地藏獒數(shù)量的銳減、品種劣化以及各種疫病的侵襲，許多藏獒販賣者又把目標轉(zhuǎn)向青海省的玉樹、果洛等地。加之2010年玉樹地震中許多藏獒因地震死亡或變成流浪獒被撲殺，使這里的藏獒資源遭到滅頂之災(zāi)。為了初步摸清CPV在青藏高原部分地區(qū)藏獒中的流行現(xiàn)狀，為以后有效防控藏獒CPV積淀流行病學(xué)資料和保護其種群繁衍提供理論依據(jù)，進一步為探索青藏高原的奧秘，探尋生存于世界屋脊的動物適應(yīng)環(huán)境的方式與能力，為全面開展對青藏高原生物多樣性保護奠定研究基礎(chǔ)。2011年10月至2012年5月，選擇較為快速的CPV-ELISA診斷試劑盒和CPV檢測試紙條對青海省部分地區(qū)藏獒血清與糞便樣品進行了血清學(xué)與病原檢測，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 待檢血清和糞便來源 隨機選取青海省河南縣、祁連縣、西寧市加旺寵物醫(yī)院和陶北村獒園的藏獒進行前肢靜脈采血，帶回實驗室后常規(guī)方法分離血清，置-20℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。同時用滅菌棉拭子在藏獒直腸深部采取糞便，應(yīng)用犬細小病毒檢測試紙條進行現(xiàn)場CPV的檢測。

1.1.2 ELISA檢測試劑盒與犬細小病毒檢測試紙條 犬細小病毒診斷試劑盒（ELISA），購自上海研招生物技術(shù)有限公司（生產(chǎn)批號：20120525）。犬細小病毒檢測試紙條，購自上?？祆`生物科技有限公司（生產(chǎn)批號：110506）。

1.2 方法

1.2.1 細小病毒（CPV）酶聯(lián)免疫分析（ELISA）每管加入滅菌生理鹽水2mL，在MM-1型微型振蕩器上振蕩，每支試管振蕩15min/次，連續(xù)3次。

1.2.1.1 加樣 分別在陰、陽性對照孔中加入陰性對照、陽性對照各50μL，然后依次在待測樣品孔中加入樣品稀釋液各40μL，最后再分別加入待測血清各10μL。加樣時將樣品加入酶標板的孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。

1.2.1.2 溫育 用封板膜封板，置37℃溫箱溫育30min。

1.2.1.3 配液 將30（48T的20倍）倍濃縮的洗滌液加入蒸餾水配制600mL后備用。

1.2.1.4 洗滌 小心揭開封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30s后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。

1.2.1.5 加酶 每孔各加入酶標試劑50μL，空白孔除外。溫育（操作同1.2.1.2），洗滌（操作同1.2.1.4）。

1.2.1.6 顯色 每孔依次加入顯色劑A 和顯色劑B各50μL，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15min。

1.2.1.7 終止 每孔各加入終止液50μL，終止反應(yīng)（此時藍色立即變成黃色）。

1.2.1.8 測定 將空白孔調(diào)零，450nm波長依序測量各吸收孔的吸光度（OD值）。測定應(yīng)在加入終止液后的15min之內(nèi)進行。

1.2.2 犬細小病毒試紙條檢測

1.2.2.1 用滅菌的棉拭子收集藏獒糞便，然后將棉拭子插入含有1mL樣品處理液的樣品管中，攪動均勻并靜置10min，待糞便沉淀于底部后再取樣品上清液進行CPV的檢測。

1.2.2.2 在犬細小病毒試紙條的加樣孔中加入2滴經(jīng)上述處理的糞便樣品，5min后觀察結(jié)果。

1.2.3 結(jié)果判定

1.2.3.1 犬細小病毒（CPV）酶聯(lián)免疫分析（ELISA） 陽性對照孔平均值≥1.00、陰性對照孔平均值≤0.10時判定試驗有效。臨界值（CUT OFF） =陰性對照孔平均值+0.15。樣品OD值＜臨界值（CUT OFF）者為犬細小病毒（CPV）抗體陰性，樣品OD值≥臨界值（CUT OFF）者為犬細小病毒（CPV）抗體陽性。

1.2.3.2 犬細小病毒（CPV）試紙條檢測 只有一條線（質(zhì)控“C”線）出現(xiàn)判定為陰性，出現(xiàn)兩條線（“C”和“T”線）判定為陽性，無質(zhì)控線出現(xiàn)判定為無效。

2 結(jié)果

2.1 犬細小病毒（CPV）酶聯(lián)免疫分析（ELISA）

應(yīng)用CPV ELISA試劑盒對青海部分地區(qū)的60份藏獒血清進行ELISA檢測，共檢出陽性糞便6份，陽性率為10.00%（6/60），與CPV試紙條檢測的陽性符合率為83.33%。在ELISA酶標板上的A1和A2號為樣性對照孔；A5和A6號為陰性對照孔；A9為空白孔。下劃線數(shù)字表示60份待檢血清樣品中CPV陽性血清的對應(yīng)OD值。經(jīng)測定，臨界值（CUT OFF）=0.056+0.15=0.206；陽性對照孔平均值=2.581；陰性對照孔平均值=0.056。詳細結(jié)果見表1、表2。

表1 青海省部分地區(qū)犬細小病毒的ELISA檢測

表2 ELISA和試紙條檢犬細小病毒測陽性數(shù)統(tǒng)計

2.2 CPV試紙條檢測

應(yīng)用CPV檢測試紙條對青海部分地區(qū)的60份藏獒糞便進行檢測，共檢出陽性糞便5份，陽性率8.33%（5/60），詳細結(jié)果見表1、表2。

3 討論與小結(jié)

3.1 CPV作為細小病毒屬中的主要成員，對犬科動物具有較強致病作用，其抗原性隨時間的遷移而不斷發(fā)生變化，導(dǎo)致諸如CPV-2a、CPV-2b、CPV-2e（a）及CPV-2C（b）亞型[6]的突變株不斷產(chǎn)生，CPV感染的宿主譜也在不斷地擴大，并在世界范圍內(nèi)廣泛傳播流行。各個國家的流行情況存在較大的差異：在意大利以CPV-2c感染為主[7-8]；烏拉圭以CPV-2c為主[9]；印度主要流行株為CPV-2a和CPV-2c；越南以CPV-2b和CPV-2c感染為主[10-11]；美國以CPV-2b和CPV-2c感染為主[12]。蘇建青等報道，1982—1996年我國以CPV-2a為主，1997年后逐漸以CPV-2b為主。此外，張國倉對內(nèi)蒙古大通縣境內(nèi)犬類疫病進行的流行病學(xué)調(diào)查顯示，因傳染病死亡的犬只占被調(diào)查犬的10.02%，其中因CPV感染死亡的占6.01%。2004—2009年期間蘭州市CPV陽性檢出率高達25.88%，其中2004—2008年間陽性檢出率呈逐漸下降趨勢，但2009年又略有上升[13]。2010年吉林市對就診的4372例疑似CPI病犬的發(fā)病情況的調(diào)查顯示其陽性率高達74.33%[14]。2009 年在南京動物醫(yī)院就診的11342 例病例中，CPI占 33.25%[15]。但國內(nèi)外針對藏獒CPV的報道相對較少，為了初步摸清CPV在青海省部分地區(qū)藏獒中的流行現(xiàn)狀，為以后有效防控藏獒CPI積累流行病學(xué)資料和保護其種群繁衍提供理論依據(jù)，本研究選用CPV ELISA試劑盒和CPV檢測試紙對青海省河南縣、祁連縣、西寧市陶北村獒園及嘉旺寵物醫(yī)院采集的樣品進行檢測，結(jié)果顯示陽性檢出率分別為10.00%（6/60）和8.33%（5/60），由X2= 0.1000，P>0.05，表明以上兩種方法差異不顯著，兩種方法的陽性符合率為83.33%（5/60）。揭示青海部分地區(qū)的藏獒可攜帶CPV或發(fā)生CPI，而此次CPV的檢出率遠低于蘭州、吉林、南京等地的檢出率，這可能與長期適應(yīng)高原惡劣自然環(huán)境的藏獒抵抗力比其他犬類較強有關(guān)。

3.2 目前，針對CPV的檢測方法種類較多，主要有常規(guī)病毒分離（VI）、電鏡檢查（EM）、血凝/血凝抑制試驗（HA/HI）、乳膠凝集試驗（LAT）、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ ELISA）、免疫層析試驗（ICA）、聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）及實時熒光定量PCR（real-time PCR）等。但這些方法各有其優(yōu)缺點，VI和LAT等方法敏感性和特異性較低。HA /HI雖有較高的特異性，但敏感性較低，而且試驗需要新鮮健康的紅細胞。EM 、PCR和ICA雖說較其它方法特異性和敏感性強，但需要較精密的儀器設(shè)備和較繁瑣的的步驟，不適于基層的推廣。ELISA的靈敏性很高，甚至高于PCR 的靈敏性，結(jié)果的準確性很高，適用于基層的大批量樣品的檢測，但對沒有血凝活性的CPV變異株[16]，易造成檢驗結(jié)果的不準確性。由于CPV 抗原檢測試紙條也存在假陽性及假陰性現(xiàn)象，在臨床應(yīng)用過程中極易受到操作者的影響，且不同生產(chǎn)廠家的試紙條敏感度和特異性也會有差異[17]，但它具有HA /HI和PCR所不具有的獨特優(yōu)點，即操作簡便、出示結(jié)果快速。為此，本研究選擇CPV ELISA診斷試劑盒和CPV檢測試紙相結(jié)合的方法，分別對青海省部分地區(qū)藏獒血清樣品中的CPV抗體和藏獒糞便中的CPV進行檢測，以期為藏獒CPV感染的流行病學(xué)診斷提供理論依據(jù)。

3.3 據(jù)調(diào)查，當前侵害藏獒的主要病毒是CPV和犬瘟熱病毒，其中CPV感染是主要影響6 周齡至6月齡藏獒存活率的原因[18]。加之西寧市是全國最大的藏獒集散地，每年約有5000只藏獒被輸出到國內(nèi)外，藏獒的流動性特別強，這也就加大了藏獒感染CPV的機率，使得在實際工作中防控藏獒CPI的難度也隨之加大。為了有效預(yù)防藏獒CPI的發(fā)生，其首要任務(wù)就是組織培訓(xùn)養(yǎng)殖戶的防病意識；其次對引種的獒犬和新生幼犬加強免疫抗體水平檢測工作，幼齡獒斷奶后應(yīng)及時應(yīng)用CPV滅活苗和犬五聯(lián)弱毒疫苗進行免疫。在常規(guī)免疫之后，再增加1～2次，間隔15～21 d，以增強免疫效果。在治療CPI的早期，應(yīng)對病獒禁食，使用CPV高免血清、單克隆抗體或用免疫球蛋白進行治療，或灌服生理鹽水以維持機體內(nèi)電解質(zhì)平衡。除了采取綜合治療措施外，良好的護理和科學(xué)的飼養(yǎng)管理極為重要，對病獒應(yīng)注意防寒保暖，飼喂易消化的食物和助消化的藥物以促進病犬消化機能的恢復(fù)。

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