谷 娟 許叢叢 蔡 旋 楊守鳳 祁 亮 徐建雄＊

（1.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海市獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200240；2.上海九川生物科技有限公司，上海201404）

規(guī)?；?、集約化養(yǎng)豬業(yè)的迅速發(fā)展，在滿足市場(chǎng)需求的同時(shí)，也帶來了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。由飼養(yǎng)環(huán)境、生產(chǎn)技術(shù)（如早期斷奶、轉(zhuǎn)群等）、營(yíng)養(yǎng)不平衡、免疫和藥物治療等造成的應(yīng)激對(duì)養(yǎng)豬生產(chǎn)的影響也越來越大。應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致豬的生長(zhǎng)性能下降，免疫力減弱，產(chǎn)品質(zhì)量下降，嚴(yán)重時(shí)引起死亡，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大損失［1］。養(yǎng)豬生產(chǎn)中廣泛使用抗生素、化學(xué)合成藥物和激素類物質(zhì)等作為飼料添加劑來提高豬只的生長(zhǎng)性能以及抗病能力，但是由于這些藥物的濫用，通常導(dǎo)致動(dòng)物體內(nèi)菌群失調(diào)、耐藥菌株的產(chǎn)生、免疫機(jī)能下降、發(fā)病或死亡、在動(dòng)物體內(nèi)的殘留對(duì)人體造成危害及環(huán)境污染等，在很大程度上制約了畜牧業(yè)的發(fā)展。尋求一種安全、高效、廉價(jià)的飼料添加劑來提高動(dòng)物生長(zhǎng)性能和抗病能力一直是動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)家關(guān)注的熱點(diǎn)。研究表明，一些微生物制劑、中草藥添加劑等均可以提高仔豬生長(zhǎng)性能以及免疫功能［2－5］。但是對(duì)于多肽類復(fù)合物對(duì)動(dòng)物機(jī)體的作用的研究報(bào)道還較少，且多集中在植物蛋白水解肽［6－7］以及乳源活性肽［8－9］上。本研究所用的復(fù)合多肽是利用多肽生物固相合成技術(shù)［10］和生物化學(xué)技術(shù)制備而成，含有免疫提高促進(jìn)肽、細(xì)胞組織修復(fù)肽以及抗菌促生長(zhǎng)肽3種生物多肽因子。本試驗(yàn)以21日齡斷奶仔豬為試驗(yàn)動(dòng)物，研究飼糧中添加一定水平的復(fù)合多肽對(duì)其生長(zhǎng)性能、抗氧化能力、基礎(chǔ)代謝水平以及免疫機(jī)能的影響，旨在為斷奶仔豬的健康生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

復(fù)合多肽由上海九川生物科技有限公司提供，采用多肽固相合成技術(shù)和生物化學(xué)技術(shù)制備而成，含有免疫提高促進(jìn)肽、細(xì)胞組織修復(fù)肽以及抗菌促生長(zhǎng)肽3種生物多肽因子。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物及飼糧

試驗(yàn)動(dòng)物選用21日齡斷奶的“杜×長(zhǎng)×大”三元雜交仔豬；基礎(chǔ)飼糧參照NRC（1998）豬的營(yíng)養(yǎng)需要以及試驗(yàn)豬場(chǎng)的飼糧配方，配制成全價(jià)粉狀料，其組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

將90頭平均體重約為8.5kg的仔豬按體重相近、公母各占1/2的原則隨機(jī)分為3組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10頭豬。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)組分別在基礎(chǔ)飼糧中添加0.5%和1.0%的復(fù)合多肽。

試驗(yàn)前對(duì)豬舍進(jìn)行消毒，預(yù)試期5d，試驗(yàn)期30d。試驗(yàn)豬采用群飼，飼喂干粉料，日喂3次，每次以吃飽略剩料為宜，自由飲水。其他飼養(yǎng)管理措施和免疫接種按豬場(chǎng)的常規(guī)程序進(jìn)行。

1.4 樣品采集與制備

1.4.1 血液采集與血清制備

試驗(yàn)第30天，分別從各重復(fù)隨機(jī)選取2頭試驗(yàn)豬前腔靜脈采集血樣，一份置于肝素鈉抗凝管中，用于淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率測(cè)定；另一份靜置后，于3 000r/min離心15min制備血清，－70℃保存，用于各項(xiàng)血清理化指標(biāo)的測(cè)定。

1.4.2 糞樣的采集

試驗(yàn)第30天，每重復(fù)隨機(jī)選取1頭試驗(yàn)豬取新鮮糞便，加入甘油于－70℃保存，用于腸道主要菌群數(shù)量分析。

1.5 指標(biāo)檢測(cè)及方法

1.5.1 生長(zhǎng)性能

以圈為單位，在試驗(yàn)開始及結(jié)束的早晨分別對(duì)試驗(yàn)豬進(jìn)行空腹稱重，記錄耗料量，計(jì)算豬的平均日增重、平均日采食量和料重比，并在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)記錄仔豬死亡頭數(shù)，計(jì)算成活率。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet（air－dry basis） %

1.5.2 血清抗氧化指標(biāo)

血清中丙二醛（MDA）含量、總超氧化物歧化酶（T－SOD）活性、總抗氧化能力（T－AOC）以及一氧化氮（NO）、過氧化氫（H2O2）含量、抑制羥自由基能力（RAHFR）均采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測(cè)定。

1.5.3 血液淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率和血清免疫指標(biāo)

采用噻唑藍(lán)（MTT）法測(cè)定外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，結(jié)果以吸光度值表示；采用ELISA試劑盒檢測(cè)血清白細(xì)胞介素－2（IL－2）、白細(xì)胞介素－6（IL－6）以及血清免疫球蛋白 A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）和免疫球蛋白 M（IgM）的含量，試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.5.4 血清激素指標(biāo)

采用ELISA試劑盒測(cè)定血清中三碘甲狀腺原氨酸（T3）、甲狀腺素（T4）、胰島素（INS）、胃泌素（GAS）和胰島素樣生長(zhǎng)因子－Ⅰ（IGF－Ⅰ）含量，試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.5.5 血清生化指標(biāo)

血清總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、尿素氮（UN）含量及堿性磷酸酶（AKP）活性的測(cè)定采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒。

1.5.6 腸道主要菌群數(shù)量

以實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)測(cè)定糞樣中總細(xì)菌、乳酸桿菌（Lactobacillus）和大腸桿菌（Escherichia coli）數(shù)量的變化。腸道總細(xì)菌、乳酸桿菌和大腸桿菌的引物序列設(shè)計(jì)參照許叢叢等［11］，引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列及參數(shù)見表2。從各組糞樣中提取細(xì)菌基因組總DNA。通過將含有目的DNA片段的瓊脂糖凝膠進(jìn)行回收、純化分別獲得總細(xì)菌、乳酸桿菌和大腸桿菌的標(biāo)準(zhǔn)品，然后將3種細(xì)菌的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，以不同標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)過程中出現(xiàn)熒光信號(hào)的初始循環(huán)數(shù)（Ct）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。同時(shí)，將待測(cè)樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)得到樣品的Ct值，并將其和標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，獲得各樣品中3種細(xì)菌數(shù)量。

表2 引物序列及參數(shù)Table 2 Primer sequence and parameters

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，并用LSD法進(jìn)行多重比較，以P＜0.05為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié) 果

2.1 復(fù)合多肽對(duì)早期斷奶仔豬生長(zhǎng)性能的影響

由表3可知，與對(duì)照組相比，添加0.5%和1.0%的復(fù)合多肽提高了仔豬平均日增重以及平均日采食量，降低了料重比，但差異均不顯著（P＞0.05），平均日增重分別比對(duì)照組提高了14.33%和13.15%，料重比分別降低了12.57%和8.57%。

2.2 復(fù)合多肽對(duì)早期斷奶仔豬血清抗氧化指標(biāo)的影響

由表4可知，與對(duì)照組相比，添加0.5%的復(fù)合多肽可顯著提高血清T－AOC和H2O2含量（P＜0.05）；添加1.0%的復(fù)合多肽顯著降低血清NO含量（P＜0.05）；添加0.5%和1.0%的復(fù)合多肽對(duì)血清T－SOD活性、MDA含量以及RAHFR均無顯著影響（P＞0.05）。

2.3 復(fù)合多肽對(duì)早期斷奶仔豬淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率及血清免疫指標(biāo)的影響

由表5可知，與對(duì)照組相比，添加復(fù)合多肽對(duì)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率無顯著影響（P＞0.05）。添加0.5%和1.0%的復(fù)合多肽提高了血清IL－2、IL－6、IgA、IgG和IgM含量，且添加1.0%的復(fù)合多肽顯著提高了血清IL－2含量（P＜0.05）。添加0.5%的復(fù)合多肽血清IgG含量較對(duì)照組提高了33.12%（P＞0.05），添加1.0%的復(fù)合多肽血清IgA和IgM含量分別較對(duì)照組提高了16.32%和17.39%（P＞0.05）。

weaner piglets

表4 復(fù)合多肽對(duì)早期斷奶仔豬血清抗氧化指標(biāo)的影響Table 4 Effects of complex polypeptide on serum antioxidant indices in early－weaner piglets

表5 復(fù)合多肽對(duì)早期斷奶仔豬淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率及血清免疫指標(biāo)的影響Table 5 Effects of complex polypeptide on lymphocyte transformation rate and serum immune indices in early－weaner piglets

2.4 復(fù)合多肽對(duì)早期斷奶仔豬血清激素指標(biāo)的影響

由表6可知，與對(duì)照組相比，添加0.5%和1.0%的復(fù)合多肽血清中 T3、T4、INS、GAS的含量均有提高，且添加1.0%的復(fù)合多肽血清T4、INS、GAS含量有顯著性提高（P＜0.05）；添加0.5%和1.0%的復(fù)合多肽血清IGF－Ⅰ含量亦有升高（P＞0.05），分別較對(duì)照組提高了21.00%和16.50%。

2.5 復(fù)合多肽對(duì)早期斷奶仔豬血清生化指標(biāo)的影響

由表7可知，與對(duì)照組相比，添加0.5%和1.0%的復(fù)合多肽血清中TP、ALB、UN含量以及AKP活性均沒有顯著性變化（P＞0.05）。

表6 復(fù)合多肽對(duì)早期斷奶仔豬血清激素指標(biāo)的影響Table 6 Effects of complex polypeptide on serum hormone indices in early－weaner piglets

表7 復(fù)合多肽對(duì)早期斷奶仔豬血清生化指標(biāo)的影響Table 7 Effects of complex polypeptide on serum biochemical indices in early－weaner piglets

2.6 復(fù)合多肽對(duì)早期斷奶仔豬腸道主要菌群數(shù)量的影響

由表8可知，與對(duì)照組相比，添加0.5%和1.0%的復(fù)合多肽總菌數(shù)量都有所增加，但無顯著性差異（P＞0.05）；而添加0.5%的復(fù)合多肽乳酸桿菌數(shù)量顯著增加（P＜0.05），大腸桿菌數(shù)量顯著降低（P＜0.05）；添加1.0%的復(fù)合多肽大腸桿菌數(shù)量顯著降低（P＜0.05）。

表8 復(fù)合多肽對(duì)早期斷奶仔豬腸道主要菌群數(shù)量的影響Table 8 Effects of complex polypeptide on the number of intestinal main microbial flora in early－weaner piglets lg（拷貝數(shù)/g）

3 討 論

本試驗(yàn)所用的復(fù)合多肽含有免疫提高促進(jìn)肽、細(xì)胞組織修復(fù)肽以及抗菌促生長(zhǎng)肽等多肽成分。該復(fù)合多肽中的免疫提高促進(jìn)肽是胸腺分泌蛋白的一種，是一種免疫增強(qiáng)劑，它能夠調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫狀態(tài)，協(xié)調(diào)內(nèi)分泌，提高機(jī)體對(duì)細(xì)菌病毒感染的抵抗力，從而提高動(dòng)物體的免疫能力，飼料中添加亦能起到促生長(zhǎng)的作用［12］。余斌等［13］試驗(yàn)表明，肉雞1～10日齡期間在基礎(chǔ)飼糧中添加1.328～2.648g/（只·d）的胸腺肽，在42日齡時(shí)平均日增重顯著高于對(duì)照組，料重比和成活率均優(yōu)于對(duì)照組，但差異不顯著?？咕膹V泛存在于多種生物體內(nèi)，是生物體非特異性免疫功能的重要組成部分，具有抗細(xì)菌、真菌、病毒等多種生物學(xué)功能［14－15］。溫劉發(fā)等［16］的研究表明，在基礎(chǔ)飼糧中用抗菌肽替代抗生素的使用可以增加仔豬的平均日增重，降低料重比。而劉莉如等［17］對(duì)公雞的試驗(yàn)也表明，基礎(chǔ)飼糧中添加一定量的抗菌肽可以增加蛋用仔公雞的平均日增重，降低料重比，并且與抗菌肽的添加劑量有一定的關(guān)系。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在基礎(chǔ)飼糧中添加不同水平的復(fù)合多肽，均可以在不同程度上提高斷奶仔豬的平均日采食量和平均日增重，降低料重比。雖然差異不顯著，但是平均日增重分別較對(duì)照組提高了14.33%和13.15%，料重比分別降低了12.57%和8.57%，增加平均日增重以及降低料重比的效果還是可以肯定的，且添加0.5%的復(fù)合多肽的效果要略優(yōu)于1.0%，這與上述報(bào)道中單一多肽的應(yīng)用結(jié)果一致，說明幾種多肽的復(fù)合物共同作用時(shí)不會(huì)產(chǎn)生拮抗作用，至于是何種成分起主要作用以及如何作用，還需進(jìn)一步的研究。

自由基過多引起生物體組織損傷、衰老以及由于自由基增加和免疫系統(tǒng)破壞帶來的免疫能力低下是現(xiàn)代養(yǎng)殖業(yè)普遍存在的問題。本研究顯示，添加0.5%的復(fù)合多肽血清T－AOC顯著上升，添加1.0%的復(fù)合多肽血清IL－2的含量也有顯著上升。T－AOC反映的是機(jī)體的氧化還原平衡狀態(tài)。IL－2主要由活化的CD4＋T細(xì)胞和CD8＋T細(xì)胞產(chǎn)生的具有廣泛生物活性的細(xì)胞因子，是所有T細(xì)胞亞群的生長(zhǎng)因子，并可促進(jìn)活化B細(xì)胞增殖，故為調(diào)控免疫應(yīng)答的重要因子。這與一些胸腺肽、抗菌肽的研究結(jié)果類似，Leichtling等［18］的研究表明，胸腺肽可以調(diào)節(jié)IL－2在正常人淋巴細(xì)胞中的表達(dá)?？咕膶?duì)機(jī)體免疫功能的影響亦有報(bào)道［19］。劉莉如等［17］的試驗(yàn)也表明，飼糧中添加350mg/kg的抗菌肽可以有效地提高蛋用仔公雞的免疫器官指數(shù)，并能降低相關(guān)炎癥因子mRNA的相對(duì)表達(dá)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，仔豬飼糧中添加不同水平的復(fù)合多肽，均可以在不同程度上提高血清中各種免疫球蛋白含量，雖然差異不顯著，但添加0.5%的復(fù)合多肽血清IgG含量較對(duì)照組提高了33.12%，添加1.0%的復(fù)合多肽血清IgA和IgM含量分別較對(duì)照組提高了16.32%和17.39%，說明該復(fù)合多肽在一定程度上有提高斷奶仔豬體液免疫、細(xì)胞免疫功能以及增加抗病能力的趨勢(shì)，且1.0%的添加水平提高免疫機(jī)能的趨勢(shì)更加明顯。這種對(duì)免疫功能的改善效果可能是其中某種單一多肽的單獨(dú)作用，也可能是幾種多肽的聯(lián)合作用。

甲狀腺激素主要包括T3和T4。甲狀腺激素可通過控制mRNA和蛋白質(zhì)的生物合成而促進(jìn)動(dòng)物體生長(zhǎng)發(fā)育。INS是機(jī)體內(nèi)唯一降低血糖的激素，也是唯一同時(shí)促進(jìn)糖原、脂肪、蛋白質(zhì)合成的激素，而GAS是一種重要的胃腸激素［20］，可促進(jìn)胃腸道的分泌功能，幫助消化吸收，二者均是參與機(jī)體基礎(chǔ)代謝的重要激素。余斌等［13］的試驗(yàn)表明，飼糧中添加一定量的胸腺肽可以提高血漿中T3、T4的含量。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加一定水平的復(fù)合多肽可以在不同程度上增加血清中T3、T4、INS、GAS以及IGF－Ⅰ的含量，并且添加1.0%的復(fù)合多肽可以顯著增加血清T4、INS、GAS的含量。結(jié)果表明，該復(fù)合多肽可以調(diào)節(jié)斷奶仔豬的內(nèi)分泌活動(dòng)，增加豬只的基礎(chǔ)代謝活動(dòng)，促進(jìn)其生長(zhǎng)發(fā)育，且1.0%的添加水平效果更加明顯。關(guān)于該復(fù)合多肽促進(jìn)動(dòng)物增重可能源于以下2個(gè)方面的原因：一是該復(fù)合多肽改善了機(jī)體的免疫功能，提高了抗病能力，緩沖了外部入侵的病原微生物造成的免疫功能紊亂，從而使機(jī)體能集中更多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)用于生長(zhǎng)；二是該復(fù)合多肽調(diào)節(jié)機(jī)體的內(nèi)分泌功能，促進(jìn)增重。此外，生長(zhǎng)激素、甲狀腺激素和免疫系統(tǒng)之間有一定關(guān)系，這些激素對(duì)某些免疫參數(shù)有促進(jìn)提高作用［21］。已有報(bào)道表明，T3、T4可使血液中T淋巴細(xì)胞總數(shù)增加［22］。

消化道菌群數(shù)量的變化是斷奶應(yīng)激引起仔豬消化道內(nèi)環(huán)境改變的主要表現(xiàn)。乳酸桿菌為動(dòng)物腸道中的有益菌群，它維護(hù)動(dòng)物健康和調(diào)節(jié)免疫功能的作用已被廣泛認(rèn)可。而大腸桿菌為條件致病菌，正常情況下，對(duì)機(jī)體起一定的有益作用，但大腸桿菌也是內(nèi)毒素的重要來源，一旦機(jī)體免疫力下降或處于應(yīng)激等狀態(tài)下，腸黏膜通透性增加，內(nèi)毒素將會(huì)進(jìn)入血液引起炎性反應(yīng)。有研究表明，斷奶后仔豬腸道乳酸桿菌數(shù)量下降，而腸桿菌（特別是大腸桿菌）的比例上升［23－24］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在飼糧中添加一定水平的復(fù)合多肽不會(huì)顯著改變腸道中總細(xì)菌的數(shù)量，但是0.5%的添加水平會(huì)顯著增加乳酸桿菌的數(shù)量，降低大腸桿菌的數(shù)量，這與已有報(bào)道［23－24］一致。上述結(jié)果表明該復(fù)合多肽可以促進(jìn)腸道有益菌群增殖，同時(shí)抑制有害菌群的增殖，調(diào)節(jié)腸道菌群的平衡，從而提高仔豬腸道健康。

4 結(jié) 論

① 飼糧中添加0.5%和1.0%的復(fù)合多肽均可以提高斷奶仔豬生長(zhǎng)性能。

② 飼糧中添加0.5%和1.0%的復(fù)合多肽均可以在一定程度上提高抗氧化能力，提高各項(xiàng)免疫指標(biāo)，進(jìn)而改善斷奶仔豬免疫功能，增加抗病能力；同時(shí)也能提高血清中 T3、T4、INS、GAS以及IGF－Ⅰ的含量，增加豬只的基礎(chǔ)代謝活動(dòng)，促進(jìn)其生長(zhǎng)發(fā)育；并能增加腸道乳酸桿菌而減少大腸桿菌的數(shù)量，維持腸道菌群平衡。

③ 在提高生長(zhǎng)性能、改善腸道健康以及提高抗氧化水平上0.5%的添加水平優(yōu)于1.0%，而1.0%的添加水平對(duì)于免疫功能和基礎(chǔ)代謝水平的增加效果要優(yōu)于0.5%。

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