王夢(mèng)芝 王 曙 王 龍 王洪榮

（揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州225009）

瘤胃微生物蛋白質(zhì)是反芻動(dòng)物重要的代謝蛋白質(zhì)源，占反芻動(dòng)物小腸食糜氨基酸的30%～100%［1］，并可提供足以維持正常生長(zhǎng)和生產(chǎn)（如一定產(chǎn)奶量）的蛋白質(zhì)，而且十二指腸食糜的氨基酸組成往往與瘤胃微生物蛋白質(zhì)的氨基酸組成近似［2］。因此，研究瘤胃微生物蛋白質(zhì)的合成規(guī)律對(duì)反芻動(dòng)物生產(chǎn)有著重要的意義。瘤胃微生物蛋白質(zhì)的產(chǎn)量受多種因素的調(diào)控［3］，研究較多的有飼糧結(jié)構(gòu)、物理有效纖維水平、陰陽(yáng)離子平衡等因素。理論上，微生物細(xì)胞分裂的速度遠(yuǎn)大于瘤胃液的外流速度（稀釋率），但由于大部分微生物（包括細(xì)菌、原蟲(chóng)和真菌等）是附著在飼料顆粒上的，因此，稀釋率是影響微生物生長(zhǎng)和微生物蛋白質(zhì)產(chǎn)量的重要因素之一。研究表明，在人工瘤胃中當(dāng)微生物數(shù)量達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)時(shí)，稀釋率可以用來(lái)代表微生物的生長(zhǎng)速度［4］。但關(guān)于稀釋率這一對(duì)微生物蛋白質(zhì)合成有重要影響的因素的研究迄今尚不多見(jiàn)。這主要是由于對(duì)活體瘤胃稀釋率的研究尚存在一定的困難，同時(shí)用于體外瘤胃稀釋率研究的雙外流人工瘤胃裝置多為專(zhuān)利性設(shè)備且造價(jià)較高，以致目前一般的實(shí)驗(yàn)室尚缺乏適宜實(shí)驗(yàn)室研究用的體外仿真瘤胃微生物連續(xù)培養(yǎng)設(shè)備。因此，迄今多數(shù)有關(guān)體外培養(yǎng)條件下瘤胃稀釋率的報(bào)道還是以靜態(tài)培養(yǎng)（沒(méi)有培養(yǎng)液的連續(xù)注入和培養(yǎng)物的外排）為試驗(yàn)條件［5－7］?，F(xiàn)有可查的少量文獻(xiàn)是關(guān)于稀釋率影響瘤胃微生物蛋白質(zhì)合成的［8－9］，而對(duì)于稀釋率調(diào)控原蟲(chóng)蛋白質(zhì)、細(xì)菌蛋白質(zhì)等微生物蛋白質(zhì)的合成規(guī)律，如不同稀釋率下以微生物蛋白質(zhì)或其他形式存在的氮素的分配情況、微生物類(lèi)群結(jié)構(gòu)和生長(zhǎng)速率、原蟲(chóng)吞噬細(xì)菌的速率等，尚不得而知。為此，本試驗(yàn)擬在體外連續(xù)培養(yǎng)條件下研究稀釋率對(duì)微生物蛋白質(zhì)和其他形式氮素的流量以及其在總氮素流量中比例分配的影響，以為進(jìn)一步研究稀釋率影響瘤胃微生物蛋白質(zhì)合成規(guī)律提供一些基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與發(fā)酵裝置

選用5只健康、平均體重為（25.6±0.5）kg裝有瘤胃瘺管的成年徐淮白山羊羯羊，統(tǒng)一驅(qū)蟲(chóng)，單圈飼養(yǎng)，按體重的2%干物質(zhì)量給料，每日08：00和20：00分2次等量飼喂，自由飲水，用于提供瘤胃液以配制培養(yǎng)液。所用人工模擬瘤胃連續(xù)發(fā)酵裝置由本實(shí)驗(yàn)室2011年完全自主研制完成。該發(fā)酵系統(tǒng)包括培養(yǎng)液罐以及發(fā)酵罐、溢流罐和集氣罐各6個(gè)，可進(jìn)行連續(xù)1周穩(wěn)定的連續(xù)培養(yǎng)試驗(yàn)，適用于瘤胃微生物體外連續(xù)培養(yǎng)，底物消化率以及產(chǎn)氣測(cè)定等試驗(yàn)研究，該設(shè)備同時(shí)配有自動(dòng)采集發(fā)酵罐樣品的采集管等，操作方便簡(jiǎn)捷。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以玉米、豆粕為精料，羊草為粗料，1mm粉碎，按精粗比40∶60（玉米∶豆粕∶羊草＝33∶7∶60）配制作為體外培養(yǎng)底物。表1為體外培養(yǎng)所用原料和培養(yǎng)底物的營(yíng)養(yǎng)水平。采用單因子3水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)，因子為稀釋率，水平分別為4%/h、6%/h、8%/h，每個(gè)水平設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.3 體外培養(yǎng)

1.3.1 人工唾液鹽配制

常用緩沖液配方改進(jìn)自McDougall緩沖液，具體組成見(jiàn)表2。人工唾液鹽以8L為1個(gè)配制單位，具體組成如下：雙蒸水6 974mL、緩沖液A（5×）960mL、礦物鹽溶液B（100×）48mL、尿素溶液C 16mL，充CO2備用。使用前加入結(jié)晶半胱氨酸鹽酸鹽2g。

1.3.2 瘤胃液采集

晨飼前，利用自制真空負(fù)壓裝置，通過(guò)瘤胃瘺管從5只山羊的瘤胃背囊、背盲囊、腹囊、腹盲囊4個(gè)位點(diǎn)采集瘤胃液各300mL，經(jīng)混合灌入經(jīng)預(yù)熱達(dá)39℃并事先通有CO2的保溫瓶中。迅速返回實(shí)驗(yàn)室，經(jīng)4層紗布過(guò)濾后，濾液通CO2并預(yù)熱至39℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 體外培養(yǎng)試驗(yàn)

每個(gè)培養(yǎng)罐中培養(yǎng)液均按人工唾液鹽與瘤胃液體積比為2∶1配制，每12h投放培養(yǎng)底物1次，投放量為20g/次，稀釋率按試驗(yàn)設(shè)計(jì)設(shè)定，持續(xù)通CO2，39℃連續(xù)培養(yǎng)。

表1 原料和培養(yǎng)底物的營(yíng)養(yǎng)水平 （干物質(zhì)基礎(chǔ)）Table 1 Nutrient levels of ingredients and culture substrate（DM basis） %

表2 體外培養(yǎng)用人工唾液鹽的組成Table 2 Composition of artificial saliva salt in vitro

1.4 樣品采集

培養(yǎng)開(kāi)始后，分別在0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24h采集培養(yǎng)罐中培養(yǎng)液樣品，立即于－20℃凍存，用于培養(yǎng)液中各種形態(tài)氮素的測(cè)定。

1.5 指標(biāo)測(cè)定

1.5.1 常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分的測(cè)定

培養(yǎng)底物及其原料的干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、灰分和中性洗滌纖維（NDF）含量參照張麗英［10］的方法測(cè)定，中性洗滌纖氮（NDFN）含量參照Licitra等［11］推薦的方法測(cè)定。

1.5.2 原蟲(chóng)蛋白質(zhì)和細(xì)菌蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

參考Wang等［12］的方法分離培養(yǎng)液樣品中的原蟲(chóng)和細(xì)菌，主要步驟如下：取培養(yǎng)液樣品，加等體積生理鹽水，39℃、125r/min孵育60min，經(jīng)80目尼龍布過(guò)濾，濾液150×g離心15min，收集沉淀為原蟲(chóng)；收集上述上清液，22 000×g離心20min，收集沉淀為細(xì)菌。采用三氯醋酸（TCA）沉淀蛋白質(zhì)法測(cè)定原蟲(chóng)蛋白質(zhì)和細(xì)菌蛋白質(zhì)含量。主要步驟如下：取分離的原蟲(chóng)或細(xì)菌樣品適量，加入10%TCA，混勻后置室溫30min，6 000×g離心10min，棄上清液再加入5%氫氧化鈉溶液混勻溶解后，6 000×g離心10min，取上清液用756型紫外分光光度計(jì)測(cè)定260和280nm下的吸光度值（OD260nm和OD280nm）。

原蟲(chóng)蛋白質(zhì)或細(xì)菌蛋白質(zhì)含量（mg/mL）＝（1.45×OD280nm－0.74×OD260nm）×稀釋倍數(shù)。

1.5.3 可溶性蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

取培養(yǎng)液樣品于SK－1快速混勻器（廈門(mén)新科）振蕩?kù)o置后經(jīng)4℃、20 000×g離心20min后，取上清液加入終濃度為0.15mol/L的高氯酸，靜置20min，再4℃、20 000×g離心20min；收集沉淀，加入2mol/L氫氧化鈉溶液水解，用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)其可溶性蛋白質(zhì)含量。所用試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.5.4 游離氨基酸氮含量的測(cè)定

取培養(yǎng)液樣品于4℃、20 000×g離心20min后，取上清液加入25%高氯酸，振蕩?kù)o置后再次4℃、20 000×g離心20min；再取上清液加入2mol/L碳酸鉀溶液，振蕩?kù)o置后再4℃、20 000×g離心20min；收集上清液用甲醛值法（GB/T 5009.39—2003）［13］測(cè)定游離氨基酸氮的含量。

1.5.5 肽含量的測(cè)定

采用雙縮脲法［14］測(cè)定培養(yǎng)液樣品中肽含量，主要步驟如下：取培養(yǎng)液樣品，加入10%TCA，混勻后靜置15min，4 000×g離心15min；取上清液加雙縮脲試劑充分混勻，室溫靜置30min，545nm下測(cè)定吸光度值。同時(shí)用牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)液重復(fù)上述步驟，做出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，進(jìn)行樣品含量的換算。

1.5.6 氨氮含量的測(cè)定

參考馮宗慈等［15］的方法測(cè)定培養(yǎng)液樣品中氨氮含量，主要步驟如下：取培養(yǎng)液樣品，4 000×g離心10min，取上清液依次加入苯酚試劑和次氯酸鈉試劑，混合均勻后60℃水浴10min，冷水冷卻后，546nm下測(cè)定吸光度值。同時(shí)用氯化銨標(biāo)準(zhǔn)液重復(fù)上述步驟，做出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，進(jìn)行樣品含量的換算。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2003整理數(shù)據(jù)，以SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件的ANOVA模塊進(jìn)行方差分析，并采用Duncan氏法分別在0.05和0.01水平進(jìn)行差異顯著性比較，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié) 果

2.1 稀釋率對(duì)原蟲(chóng)蛋白質(zhì)和細(xì)菌蛋白質(zhì)含量動(dòng)態(tài)變化的影響

4%/h、6%/h、8%/h稀釋率下記錄的培養(yǎng)液中原蟲(chóng)蛋白質(zhì)含量的變動(dòng)范圍分別為0.67～1.22mg/mL、0.56～1.20mg/mL、0.21～1.12mg/mL。從其24h內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化（圖1）看，各稀釋率下原蟲(chóng)蛋白質(zhì)含量均大致呈先上升后下降，再上升繼而再下降的趨勢(shì)；投料后6h時(shí)到達(dá)第1個(gè)高峰，而后下降；再次投料后6h即培養(yǎng)18h時(shí)達(dá)到第2個(gè)高峰，之后再下降。

4%/h、6%/h、8%/h稀釋率下記錄的培養(yǎng)液中細(xì)菌蛋白質(zhì)含量的變動(dòng)范圍分別為0.68～0.88mg/mL、0.56～0.83mg/mL、0.34～0.78mg/mL。圖2表明，各稀釋率下細(xì)菌蛋白質(zhì)含量變化均較為復(fù)雜，隨培養(yǎng)時(shí)間的延續(xù)大致呈先上升后下降，再上升和下降，再次投料后又先上升后下降，繼而又上升和下降的波動(dòng)變化，培養(yǎng)6、10、18、22h時(shí)為峰值點(diǎn)。

圖1 培養(yǎng)液中原蟲(chóng)蛋白質(zhì)含量的動(dòng)態(tài)變化Fig.1 Dynamic changes of protozoal protein content in culture solution

2.2 稀釋率對(duì)可溶性蛋白質(zhì)和游離氨基酸氮含量動(dòng)態(tài)變化的影響

4%/h、6%/h、8%/h稀釋率下記錄的培養(yǎng)液中可溶性蛋白質(zhì)含量的變動(dòng)范圍分別為0.41～0.78mg/mL、0.40～0.77mg/mL、0.39～0.78mg/mL。從其24h內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化（圖3）看，各稀釋率下變化趨勢(shì)大致相同，均呈現(xiàn)出先下降后上升，再下降和上升的趨勢(shì)。其中，在投料后4h時(shí)出現(xiàn)第1個(gè)谷值，再次投料后4h即培養(yǎng)16h時(shí)出現(xiàn)第2個(gè)谷值。

4%/h、6%/h、8%/h稀釋率下記錄的培養(yǎng)液中游離氨基酸氮含量的變動(dòng)范圍分別為25.85～44.38μg/mL、25.08～38.24μg/mL、24.42～31.97μg/mL。其24h內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化見(jiàn)圖4，隨培養(yǎng)時(shí)間的延續(xù)，各稀釋率下均呈現(xiàn)先上升、下降再上升、下降，最后又上升的趨勢(shì)。其中，投料后到2h的時(shí)間內(nèi)上升，之后下降至4h，然后緩慢上升至12h；再次投料后變化趨勢(shì)一致，但游離氨基酸氮含量的整體波動(dòng)水平略有所提高。

圖2 培養(yǎng)液中細(xì)菌蛋白質(zhì)含量的動(dòng)態(tài)變化Fig.2 Dynamics changes of bacterial protein content in culture solution

圖3 培養(yǎng)液中可溶性蛋白質(zhì)含量的動(dòng)態(tài)變化Fig.3 Dynamic changes of soluble protein content in culture solution

2.3 稀釋率對(duì)肽和氨氮含量動(dòng)態(tài)變化的影響

4%/h、6%/h、8%/h稀釋率下記錄的培養(yǎng)液中肽含量的變動(dòng)范圍分別為10.88～21.97mg/dL、10.78～18.55mg/dL、9.58～15.19mg/dL。從圖5可知，各稀釋率下肽含量動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)大致相同，均呈現(xiàn)出先升高后降低，而后又略有上升的趨勢(shì)。其中，投料后2h內(nèi)，各組肽含量均有大幅度上升，4%/h組和6%/h組先緩慢上升至6h再下降，而8%/h組持續(xù)下降，投料后10h為各組肽含量的最低點(diǎn)。

圖4 培養(yǎng)液中游離氨基酸氮含量的動(dòng)態(tài)變化Fig.4 Dynamic changes of free amino acid nitrogen content in culture solution

圖5 培養(yǎng)液中肽含量的動(dòng)態(tài)變化Fig.5 Dynamic changes of peptide content in culture solution

圖6 培養(yǎng)液中氨氮含量的動(dòng)態(tài)變化Fig.6 Dynamic changes of ammonia nitrogen content in culture solution

4%/h、6%/h、8%/h稀釋率下記錄的培養(yǎng)液中氨氮含量的變動(dòng)范圍分別為5.11～8.83mg/dL、4.28 ～ 8.50mg/dL、2.80 ～7.67mg/dL。由圖6可知，隨培養(yǎng)時(shí)間的延續(xù)，各稀釋率下氨氮含量均大致呈現(xiàn)先升高后下降，再升高和下降，后又有所升高的變化趨勢(shì)。其中，2、14h時(shí)為峰值點(diǎn)，而6和18h為谷值點(diǎn)。

2.4 稀釋率對(duì)培養(yǎng)液中氮素分配的影響

如表3所示，培養(yǎng)液中原蟲(chóng)蛋白質(zhì)和細(xì)菌蛋白質(zhì)含量均隨稀釋率的升高呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。其中，原蟲(chóng)蛋白質(zhì)含量4%/h組與8%/h組差異極顯著（P＜0.01），6%/h組與8%/h組差異顯著（P＜0.05），但4%/h組與6%/h組差異不顯著（P＞0.05）；細(xì)菌蛋白質(zhì)含量4%/h組與8%/h組差異極顯著（P＜0.01），4%/h組與6%/h組差異顯著（P＜0.05），6%/h組與8%/h組差異顯著（P＜0.05）。培養(yǎng)液中可溶性蛋白質(zhì)含量隨稀釋率的升高而下降，但各組間差異不顯著（P＞0.05）。培養(yǎng)液中游離氨基酸氮含量也隨稀釋率的升高而下降，僅4%/h組與8%/h組之間存在極顯著差異（P＜0.01）。隨著稀釋率的升高，培養(yǎng)液中肽和氨氮含量也呈下降趨勢(shì)。其中，肽含量4%/h組與8%/h組差異極顯著（P＜0.01），4%/h組與6%/h組差異顯著（P＜0.05），6%/h組與8%/h組差異極顯著（P＜0.01）；氨氮含量4%/h與8%/h組差異極顯著（P＜0.01），6%/h組與8%/h組差異顯著（P＜0.05），但4%/h組與6%/h組差異不顯著（P＞0.05）。

將所測(cè)各類(lèi)別氮素指標(biāo)轉(zhuǎn)化為氮量，按其稀釋率以24h計(jì)各類(lèi)別氮素的流量及其在總氮素流量中所占比例，結(jié)果如圖7所示。隨著稀釋率的升高，各類(lèi)別氮素流量都有所提高，但其在總氮素流量中所占比例有所不同。原蟲(chóng)蛋白質(zhì)中氮素流量 在 4%/h、6%/h、8%/h 稀 釋 率 下 分 別 為256.32、367.20、385.92mg/d，其在總氮素流量中所占比例范圍為29%～31%，以6%/h組的比例最高，為31%。細(xì)菌蛋白質(zhì)中氮素流量在4%/h、6%/h、8%/h稀釋率下分別為218.88、289.44、328.32mg/d，其在總氮素流量中所占比例范圍為24%～26%，隨稀釋率的升高而下降，以4%/h組的比例最高，為26%。微生物蛋白質(zhì)（原蟲(chóng)蛋白質(zhì)和細(xì)菌蛋白質(zhì)之和）中氮素流量和其在總氮素流量中所占比例在4%/h、6%/h、8%/h稀釋率下分別為475.20mg/d和56%、656.64mg/d和56%、714.24mg/d和53%，以6%/h組流量相對(duì)較高，且比例沒(méi)有下降。可溶性蛋白質(zhì)中氮素流量在4%/h、6%/h、8%/h稀 釋 率 下 分 別 為 178.56、263.52、345.60mg/d，其在總氮素流量中所占比例范圍為21%～26%，隨稀釋率的升高而升高，以8%/h組的比例最高，為26%。此外，不同稀釋率下，游離氨基酸氮、肽、氨氮中氮素流量在總氮素流量中所占比例范圍分別為6%、5%～6%、10%～11%，總體上變化不大。

表3 體外連續(xù)培養(yǎng)條件下稀釋率對(duì)培養(yǎng)液中各種氮素含量（24h均值計(jì)）的影響Table 3 Effects of dilution rate on various nitrogen contents（expressed as mean value of 24h）in culture solution under the condition of continuous culture in vitro

圖7 體外連續(xù)培養(yǎng)條件下稀釋率對(duì)培養(yǎng)液中氮素分配的影響Fig.7 Effects of dilution rate on nitrogen distribution in culture solution by in vitro continuous culture

3 討 論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，隨培養(yǎng)時(shí)間的延續(xù)，不同稀釋率下培養(yǎng)液中的原蟲(chóng)蛋白質(zhì)、細(xì)菌蛋白質(zhì)、可溶性蛋白質(zhì)、肽、游離氨基酸氮、氨氮的含量皆呈波動(dòng)變化；再次投料后其變化趨勢(shì)基本一致。這可能是由于投料后微生物對(duì)培養(yǎng)液中含氮物質(zhì)的降解、微生物增殖對(duì)可利用形式氮素的利用［16－18］、微生物生長(zhǎng)的平臺(tái)期抑制、微生物間的互作等效應(yīng)［19－20］以 及 微 生 物 本 身 的 自 溶［21］等 原 因 導(dǎo) 致 了所檢測(cè)的各種形式的氮素含量發(fā)生了波動(dòng)變化。

在本試驗(yàn)所設(shè)定的稀釋率范圍內(nèi)，原蟲(chóng)蛋白質(zhì)、細(xì)菌蛋白質(zhì)、可溶性蛋白質(zhì)、肽、游離氨基酸氮、氨氮的含量隨稀釋率的升高都有所下降。但是，按其稀釋率以24h計(jì)各類(lèi)別氮素流量的結(jié)果表明，各類(lèi)別氮素流量隨稀釋率的升高又都有所提高，以稀釋率為8%/h時(shí)的流量最高。這提示，一定范圍內(nèi)增加稀釋率提高了微生物蛋白質(zhì)中氮素的流量（4%/h、6%/h、8%/h稀釋率下原蟲(chóng)蛋白質(zhì)和細(xì)菌蛋白質(zhì)之和的氮素流量分別為475.20、656.64、714.24mg/d）。對(duì)于原蟲(chóng)，可能是由于稀釋率增加提高了內(nèi)容物的外排速率［22－24］，原蟲(chóng)的外流量也隨之增加，進(jìn)而減少了原蟲(chóng)的滯留和自溶，而在總體上增加了原蟲(chóng)蛋白質(zhì)中氮素的流量。細(xì)菌蛋白質(zhì)中氮素流量增加的結(jié)果與Isaacson等［25］和 Maeng等［26］的研究結(jié)果一致。其原因可能是由于稀釋率提高降低了培養(yǎng)液中原蟲(chóng)的含量，進(jìn)而降低了原蟲(chóng)吞噬細(xì)菌的能力［27－29］，使得培養(yǎng)液中細(xì)菌蛋白質(zhì)流量增加；或者也可能是因?yàn)橄♂屄试黾犹岣吡藘?nèi)容物的外排速率，促進(jìn)了培養(yǎng)液中細(xì)菌增殖活性和細(xì)菌蛋白質(zhì)合成效率［26］所致。但該結(jié)果與Martínez等［30］得到的隨稀釋率的增加液相菌增加而固相菌減少不盡一致，其原因可能是由于研究的對(duì)象（細(xì)菌vs.液相菌和固相菌）、設(shè) 置 的 稀 釋 率 （4%/h、6%/h、8%/h vs.3.78%/h、5.42%/h）等都有所不同所致。由此也說(shuō)明，稀釋率對(duì)微生物蛋白質(zhì)中氮素影響規(guī)律與機(jī)制的闡明還需要進(jìn)一步開(kāi)展深入的試驗(yàn)研究。

在本試驗(yàn)設(shè)置的稀釋率范圍內(nèi)，隨稀釋率的升高，24h內(nèi)微生物蛋白質(zhì)中氮素流量增加。但微生物蛋白質(zhì)中氮素的比例分配是否也有同樣的趨勢(shì)呢？本研究還同時(shí)對(duì)不同稀釋率下各類(lèi)別氮素流量在總氮素流量中的比例變化情況進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，原蟲(chóng)蛋白質(zhì)中氮素流量在總氮素流量中所占比例在4%/h、6%/h、8%/h稀釋率下分別為30%、31%、29%，以稀釋率為6%/h時(shí)的比例最高；而細(xì)菌蛋白質(zhì)中氮素流量在總氮素流量中所占比例則隨稀釋率的升高持續(xù)下降，在4%/h、6%/h、8%/h稀釋率下分別為26%、25%、24%，以稀釋率為8%/h時(shí)的比例最低；而微生物蛋白質(zhì)（原蟲(chóng)蛋白質(zhì)和細(xì)菌蛋白質(zhì)之和）中氮素流量在總氮素流量中所占比例在4%/h、6%/h、8%/h稀釋率下分別為56%、56%、53%，以稀釋率8%/h時(shí)比例較低。以上結(jié)果提示，在本試驗(yàn)底物精粗比40∶60的條件下，稀釋率對(duì)微生物蛋白質(zhì)中氮素流量在總氮素流量中的比例有調(diào)控效應(yīng)，以稀釋率為6%/h時(shí)的原蟲(chóng)蛋白質(zhì)中氮素在總氮素流量中所占比例最高（31%vs.30%、29%），此稀釋率下細(xì)菌蛋白質(zhì)中氮素在總氮素流量中所占比例的下降不大（25%vs.26%、24%），微生物蛋白質(zhì)（原蟲(chóng)蛋白質(zhì)和細(xì)菌蛋白質(zhì)之和）中氮素在總氮素流量中所占比例尚未下降（56%vs.56%、53%），而且此時(shí)氮素流量（4%/h：475.20mg/d；6%/h：656.64mg/d；8%/h：714.24mg/d）也 較高。此外，可溶性蛋白質(zhì)中氮素流量在總氮素流量中所占比例隨稀釋率的升高持續(xù)增加，在4%/h、6%/h、8%/h稀釋率下分別為21%、22%、26%，推測(cè)可能是由于稀釋率的升高降低了培養(yǎng)液中微生物蛋白質(zhì)的含量，進(jìn)而降低了微生物對(duì)培養(yǎng)液中可溶性蛋白質(zhì)的代謝利用率所致。其中，稀釋率為6%/h時(shí)的影響尚不明顯（22%vs.21%），而稀釋率為8%/h時(shí)的影響已經(jīng)較為明顯（26%vs.21%）。綜上，在底物精粗比40∶60條件下，在一定范圍內(nèi)改變稀釋率可調(diào)控培養(yǎng)液中氮素的流量和其比例分配，并以稀釋率為6%/h時(shí)的微生物蛋白質(zhì)中氮素流量和其在總氮素流量中所占比例較高。

4 結(jié) 論

稀釋率影響體外連續(xù)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)液中氮素的流量和比例分配，并以稀釋率為6%/h時(shí)的微生物蛋白質(zhì)中氮素流量和其在總氮素流量中所占比例（流量656.64mg/d、占總氮素流量比例56%）較高。

［1］ CLARK J H，KLUSMEYER T H，CAMERON M R.Symposium：nitrogen metabolism and amino acid nutrition in dairy cattle［J］.Journal of Dairy Science，1992，75：2304－2323.

［2］ STERN M D，VARGA G A，CLARK J H，et al.Evaluation of chemical and physical properties of feeds that affect protein metabolism in the rumen［J］.Journal of Dairy Science，1994，77：2762－2786.

［3］ PATHAK A K.Various factors affecting microbial protein synthesis in the rumen［J］.Veterinary World，2008，1：186－189.

［4］ HARRISON D G，BEEVER D E，THOMSON D J，et al.Manipulation of fermentation in the rumen［J］.Journal of the Science of Food and Agriculture，1976，27：617－620.

［5］ SUHARTI S，ASTUTI D A，WINA E，et al.Rumen microbial population in the in vitro fermentation of different ratios of forage and concentrate in the presence of whole lerak（Sapindus rarak）fruit extract［J］.Asian－Australia Journal of Animal Science，2011，24：1086－1091.

［6］ BARAKA T A M，ABDL－RAHMAN M A.In vitro evaluation of sheep rumen fermentation pattern after adding different levels of eugenol－fumaric acid combinations［J］.Veterinary World，2012，5：110－117.

［7］ WAMBUI C C，ANDO S，ABDULRAZAK S A，et al.In vitro assessment of ruminal fermentation characteristics of tropical browse mixtures supplemented with yeast［J］.Grassland Science，2012，58：53－57.

［8］ 孟慶翔，KERLEY M S.瘤胃稀釋率對(duì)蛋白質(zhì)發(fā)酵和微生物生長(zhǎng)效率的影響［J］.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，1998，31：72－78.

［9］ 孟慶翔，高仲元，KERLEY M S，等.稀釋率對(duì)于活體外瘤胃發(fā)酵和微生物生長(zhǎng)效率的影響［J］.動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，1999，11：10－16.

［10］ 張麗英.飼料分析及飼料質(zhì)量檢測(cè)技術(shù)［M］.2版.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2003.

［11］ LICITRA G，HERNANDEZ T M，VAN SOEST P J.Standardization of procedures for nitrogen fractionation of ruminant feeds［J］.Animal Feed Science and Technology，1996，57：347－358.

［12］ WANG M Z，WANG H R，LI G X，et al.Effects of rations in different starch to filter paper ratio on rumen fermentation and microbes in vitro［J］.Acta Nutrimenta Sinica，2007，6：654－662.

［13］ 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.GB/T 5009.39—2003醬油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法［S］.北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2003.

［14］ 畢葳，邢延一，李燕燕，等.應(yīng)用雙縮脲反應(yīng)測(cè)定鱉甲中總肽含量的方法學(xué)研究［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17（15）：63－65.

［15］ 馮宗慈，高民.通過(guò)比色測(cè)定瘤胃液氨氮含量方法的改進(jìn)［J］.畜牧與飼料科學(xué)：畜牧特刊，2010，31（6/7）：37.

［16］ REDDY N M，REDDY G V N，REDDY M R.Effect of fodder based complete diets on the rumen fermentation pattern in crossbred bulls［J］.Indian Journal of Animal Science，1993，10：7－12.

［17］ BRODERICK G A，REYNAL S M.Effect of source of rumen－degraded protein on production and ruminal metabolism in lactating dairy cows［J］.Journal of Dairy Science，2009，92：2822－2834.

［18］ BRODERICK G A，HUHTANEN P，AHVENJARVI S，et al.Quantifying ruminal nitrogen metabolism using the omasal sampling technique in cattle—a meta－analysis［J］.Journal of Dairy Science，2010，93：3216－3230.

［19］ KOENIG K M，NEWBOLD C J，MCINTOSH F M，et al.Effects of protozoa on bacterial nitrogen recycling in the rumen［J］.Journal of Animal Science，2000，78：2431－2445.

［20］ NHAN N T H，NGU N T，THIET N，et al.Determination of the optimum level of a soybean oil drench with respect to the rumen ecosystem，feed intake and digestibility in cattle［J/OL］.Livestock Research for Rural Development，2007，19（8）：［2007－08－06］.http：//www. cipav. org. co/lrrd/lrrd19/8/nhan19117.htm.

［21］ JOUNAY J P，USHIDA K.The role of protozoa in feed digestion review［J］.Asia－Australia Journal of Animal Science，1999，12：113－128.

［22］ ABE M，KUMENO F.In vitro simulation of rumen fermentation：apparatusand effects of dilution rat and continuous dialysis on fermentation and protozoal population［J］.Journal of Animal Science，1973，36：941－948.

［23］ CRAWFORD R J Jr.，HOOVER W H，JUNKINS L L.Effects of solids and liquid flows on fermentation in continuous cultures.Nitrogen partition and efficiency of microbial synthesis［J］.Journal of Animal Science，1980，51：986－895.

［24］ ESTELL R E Ⅱ，GALYEAN M L.Relationship of rumen fluid dilution rate to rumen fermentation and dietary characteristics of beef steers［J］.Journal of Animal Science，1985，60：1061－1071.

［25］ ISAACSON H R，HINDS F C，BRYANT M B，et al.Efficiency of energy utilization by mixed rumen bacteria in continuous culture［J］.Journal of Dairy Science，1975，58：1645－1659.

［26］ MAENG W J，CHANG M B，YUN H S.Dilution rates on the efficiency of rumen microbial growth in continuous culture［J］.Asia－Australia Journal of Animal Science，1989，2：477－480.

［27］ COLEMAN G S，SANDFORD D C.The engulfment and digestion of mixed rumen bacteria and individual bacterial species by single and mixed species of rumen ciliate protozoa grownin vivo［J］.The Journal of Agricultural Science，1979，92：729－742.

［28］ NEWBOLD C J，HILLMAN K.The effect of ciliate protozoa on the turnover of bacterial and fungal protein in the rumen of sheep［J］.Letters in Applied Microbiology，1990，11：100－102.

［29］ WANG M Z，WANG H R，YU L H.Effects of forage level in diet on bacterial protein recycling in goat’rumen［J］.Research Journal of Animal Science，2010，4：10－15.

［30］ MARTíNEZ M E，RANILLA M J，RAMOS S，et al.Effects of dilution rate and retention time of concentrate on efficiency of microbial growth，methane production，and ruminal fermentation in Rusitec fermenters［J］.Journal of Dairy Science，2009，92：3930－3938.