田 青 季 昀 龐學(xué)燕 王洪榮

（揚州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚州225009）

隨著人們生活水平的提高，牛奶已經(jīng)成為一種飲食中不可或缺的營養(yǎng)豐富的食品。為消費者提供安全優(yōu)質(zhì)的奶制品，首先要有安全優(yōu)質(zhì)的原料奶，但目前我國的原料奶中乳脂肪和乳蛋白含量普遍低于發(fā)達國家10%左右，而我國人均牛奶占有量僅是世界平均水平的1/4［1］，因此，提高牛奶產(chǎn)量和改善乳品質(zhì)迫在眉睫。乳中90%以上的蛋白質(zhì)是在乳腺中由氨基酸從頭合成的，其中酪蛋白約占乳中粗蛋白質(zhì)總量的80%，它的組成成分（α－酪蛋白、β－酪蛋白、κ－酪蛋白、γ－酪蛋白）對乳品品質(zhì)有很大的影響。胰島素（INS）作為機體內(nèi)唯一降低血糖和唯一同時促進糖原、脂肪、蛋白質(zhì)合成的激素，對于奶牛乳腺上皮細胞乳蛋白合成的作用也顯得異常重要。對于INS的研究前人已經(jīng)取得了一定的成果，但多以體內(nèi)研究為主。在調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)代謝方面，體內(nèi)研究表明，泌乳早期灌注INS可以增加牛奶產(chǎn)量、牛奶蛋白質(zhì)總量和酪蛋白含量，與生長激素同時作用效果更好［2］，另外，同時補充乳蛋白合成前體物氨基酸時，INS可以顯著增加血流量，增加細胞對氨基酸的攝?。?－5］，進而促進蛋白質(zhì)的合成；體外研究表明，INS可以和催乳素（PRL）、生長激素一樣直接影響細胞的增殖和激素的分泌，且這種作用與濃度有關(guān)［6－7］。INS還可以促進營養(yǎng)重分配，抑制蛋白質(zhì)的分解，因而有利于生長，糖皮質(zhì)激素的存在可以促進這種作用，生長激素的促蛋白質(zhì)合成作用，必須有INS的存在才能表現(xiàn)出來［8－9］。在作用機理方面，就目前研究進展來看，一是血流量調(diào)控，二是經(jīng)過磷脂酰肌醇－3－激酶－雷帕霉素靶蛋白（PI3K－mTOR）信號通路發(fā)揮作用［10］。由此可見，INS對哺乳動物生長、泌乳和乳蛋白的合成均具有一定作用，因此，闡明INS對奶牛乳腺上皮細胞乳蛋白合成的作用機理就顯得很有必要。

為了了解INS對奶牛乳蛋白合成的影響的作用機理，本研究以奶牛乳腺上皮細胞為模型，研究不同濃度INS對奶牛乳腺上皮細胞中αs1－酪蛋白（CSN1S1）基因、雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路及Janus激酶－信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子（JAKSTAT）信號通路中相關(guān)基因表達的影響，進而得到INS使用的最佳濃度并闡明外源INS對乳蛋白合成的影響及其在奶牛乳腺上皮細胞中促進乳蛋白基因表達的作用機理。研究結(jié)果對進一步通過信號通路中關(guān)鍵控制點來調(diào)控乳蛋白基因表達及奶牛乳腺乳蛋白的合成的研究有一定的學(xué)術(shù)意義，同時為在生產(chǎn)中提高奶牛產(chǎn)奶量和改善乳品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試劑：INS、PRL、氫化可的松（HYD）（Sigma，美國）；DMEM/F12、雙抗、胎牛血清（FBS）、表皮生長因子（EGF）、胰島素－轉(zhuǎn)鐵蛋白－硒（ITS）、磷酸鹽緩沖液（PBS）、兩性霉素B（Gibco，美國）。

儀器：倒置熒光顯微鏡（Leica，德國）、二氧化碳 培 養(yǎng) 箱 （Thermo，美 國）、Image Quant Capture 3000凝膠成像系統(tǒng)（GE，美國）、Eppendorf Thermal Cycler PCR 儀（Eppendorf，德 國）、海 爾 DW－86L388－86℃超低溫冰箱（海爾集團）、Eppendorf移液器（Eppendorf，德國）、LDZX－50KBS型立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）、DYCP－31C型瓊脂糖水平電泳儀（槽）（北京六一儀器廠）、SW－CJ－1D型單人雙面凈化工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）、DK－8B型電熱恒溫水槽（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）、Eppendorf Centrifuge 5415R冷凍離心機（Eppendorf，德國）、NanoDrop ND－1000濃度測定儀（GE，美國）、ABI7500熒光定量PCR儀（Applied Biosystems，美國）。

奶牛乳腺組織：來源于揚州大學(xué)農(nóng)牧場健康的泌乳期的中國荷斯坦奶牛。

1.2 方法

1.2.1 奶牛乳腺細胞的原代培養(yǎng)

選擇健康的泌乳期奶牛，采用無菌操作方法［11］進行活體采樣，即將奶牛乳房的毛剔去，75%的酒精清洗消毒后，用無菌的手術(shù)剪在乳房底部至乳頭連線的中部做一個2cm大的切口，切取5g左右的乳腺實質(zhì)組織，移入含F(xiàn)BS（10%）、青霉素（300IU/mL）、鏈 霉 素 （300IU/mL）的 DMEM/F12培養(yǎng)基中，置于冰盒帶回實驗室，用PBS（含100IU/mL青霉素、100IU/mL鏈霉素）清洗3遍，洗去乳汁和血污之后，去除脂肪和結(jié)締組織，采用酶消化法［12］處理余下的乳腺腺泡，將細胞接種到25cm2培養(yǎng)瓶，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 細胞的純化與傳代

根據(jù)成纖維細胞與上皮細胞對胰蛋白酶耐受時間的不同及2種細胞貼壁速度的差異，采用胰蛋白酶差時消化法及差速貼壁分離法對奶牛乳腺上皮細胞進行純化［12］。待細胞長滿90%以后，用0.25%胰酶消化、傳代并凍存。對細胞中角蛋白－18進行鑒定后，用實時熒光定量PCR方法檢測奶牛乳腺上皮細胞中CSN1S1基因及mTOR和JAK－STAT信號通路中相關(guān)基因表達量。

1.3 試驗設(shè)計

采用單因素試驗設(shè)計，選用4代的細胞，于復(fù)蘇后等密度接種于6孔板，待細胞長滿70%～80%時，先用無血清無激素含有雙抗和兩性霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基過渡16h以上，然后分別用含有0（對照組）、2.5、25.0、250.0、5 000.0ng/mL INS的生長培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞24h，收獲細胞，提取RNA，測定濃度，制備實時熒光定量PCR反應(yīng)液，用于相關(guān)基因的檢測。各基因表達量用2－ΔΔCt值表示。

1.4 相關(guān)基因引物設(shè)計

以甘油醛－3－磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參基因，采用Primer 3軟件進行引物設(shè)計，引物信息見表1。

表1 引物信息Table 1 Information of primers

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

所有原始數(shù)據(jù)先用Excel 2003進行整理，用SAS 9.1中ANOVA進行顯著性分析，Tukey法進行多重比較，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。數(shù)據(jù)統(tǒng)計的最終結(jié)果用平均值±標準誤表示。

2 結(jié) 果

2.1 INS對奶牛乳腺上皮細胞CSN1S1基因表達量的影響

由表2可知，與0ng/mL組（對照）相比，添加INS能夠促進奶牛乳腺上皮細胞CSN1S1基因的表達，各INS組CSN1S1基因表達量均高于0ng/mL組，其中25.0ng/mL INS作用效果最好，極顯著高于0ng/mL組（P＜0.01）。

2.2 INS對奶牛乳腺上皮細胞mTOR信號通路相關(guān)基因表達量的影響

由表3可知，與0ng/mL組相比，添加2.5、25.0和250.0ng/mL INS顯 著 或 極 顯 著 提 高PKB基因表達量（P＜0.05或P＜0.01）；INS能提高S－PRLR基因表達量，其中25.0和250.0ng/mL組極顯著高于0ng/mL組（P＜0.01），5 000.0 ng/mL組顯著高于0ng/mL組（P＜0.05）；從mTOR基因表達量來看，2.5和25.0ng/mL組極顯著高于0ng/mL組（P＜0.01），250ng/mL組也高于0ng/mL組，但差異不顯著（P＞0.05），5 000.0 ng/mL組極顯著低于0ng/mL組（P＜0.01）；對于4E－BP1基因表達量而言，2.5和25.0ng/mL組極顯 著 高 于 0ng/mL 組 （P＜0.01），250.0 和5 000.0ng/mL組也高于0ng/mL組，但差異不顯著（P＞0.05），且隨著濃度的增加表達量呈下降趨勢。以上數(shù)據(jù)顯示，INS能夠通過mTOR信號通路來調(diào)節(jié)CSN1S1基因的表達，但是INS的濃度過大反而不利于這些基因的表達。

2.3 INS對奶牛乳腺上皮細胞JAK－STAT信號通路相關(guān)基因表達量的影響

由表4可知，與0ng/mL組相比，INS可增加奶牛乳腺上皮細胞JAK－STAT信號通路中JAK2和STAT5 A基因表達量。對JAK2基因表達量而言，2.5ng/mL組顯著高于0ng/mL組（P＜0.05），25.0 和 250.0ng/mL組則極顯著高于0ng/mL組（P＜0.01），而5 000.0ng/mL組高于0ng/mL 組，但差異不顯著（P＞0.05）；對于STAT5A基因表達量而言，2.5、25.0和250.0ng/mL組均極顯著高于0ng/mL組（P＜0.01），而5 000.0ng/mL組低于0ng/mL組，但差異不顯著（P＞0.05）。

表2 INS對奶牛乳腺上皮細胞CSN1S1基因表達量的影響Table 2 Effects of INS on expression level of CSN1S1gene in bovine mammary epithelial cells

表3 INS對奶牛乳腺上皮細胞mTOR信號通路相關(guān)基因表達量的影響Table 3 Effects of INS on expression levels of mTOR signal pathway related genes in bovine mammary epithelial cells

表4 INS對奶牛乳腺上皮細胞JAK－STAT信號通路相關(guān)基因表達量的影響Table 4 Effects of INS on expression levels of JAK－STAT signal pathway related genes in bovine mammary epithelial cells

2.4 INS濃度與各基因表達量間的相關(guān)性分析

由表5、表6和表7可知，當INS濃度在0～5 000.0ng/mL時，JAK2與S－PRLR 基因表達量間呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與CSN1S1（P＝0.061）和STAT5 A（P＝0.090）基因表達量間有呈顯著正相關(guān)的趨勢；S－PRLR與CSN1S1基因表達量間有呈顯著正相關(guān)的趨勢（P＝0.098）；STAT5 A與mTOR、4E－BP1基因表達量間呈顯著或極顯著正相關(guān)（P＜0.05或P＜0.01）；INS濃度與其他基因表達量間無顯著相關(guān)（P＞0.05）。

當INS濃度在0～25.0ng/mL時，S－PRLR與CSN1S1基因表達量間、INS濃度與S－PRLR、CSN1S1基因表達量間及4E－BP1與STAT5 A基因表達量間呈顯著的正相關(guān)（P＜0.05）。

當INS濃度在25.0～5 000.0ng/mL時，INS濃度與JAK2基因表達量間呈顯著負相關(guān)（P＜0.05），與S－PRLR基因表達量間有呈負相關(guān)的趨勢（P＝0.073），4E－BP1與CSN1S1基因表達量間、PKB與mTOR基因表達量間呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。

表5 INS濃度（0～5 000.0ng/mL）與各基因表達量間的相關(guān)性分析Table 5 Correlative analysis of INS concentration（0to 5 000.0ng/mL）and gene expression levels

3 討 論

3.1 INS對奶牛乳腺上皮細胞mTOR信號通路的影響

mTOR是一種非典型的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，mTOR信號通路由于處于生長調(diào)節(jié)的中心環(huán)節(jié)而倍受關(guān)注［14］。mTOR是細胞內(nèi)多種重要信號傳導(dǎo)通路的調(diào)控蛋白，調(diào)控著細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的翻譯起始、轉(zhuǎn)錄、蛋白合成及降解功能，進而調(diào)節(jié)細胞的生長、增殖和凋亡等重要環(huán)節(jié)［15－19］。在哺乳動物細胞中，INS是通過磷脂酰肌醇－3－激酶－蛋白激酶B－雷帕霉素靶蛋白（PI3K－PKB－mTOR）信號通路［20－22］與其受體結(jié)合而激活PKB，活化的PKB可以直接磷酸化 mTOR［23］，而PKB能夠控制細胞的生長和增殖。INS還是一個重要的中間代謝的調(diào)節(jié)因子，它的作用具有雙向性，既可以通過激活mTOR下游的轉(zhuǎn)錄因子和通過真核細胞翻譯啟動因子2（eIF2）的作用去除PKB的調(diào)節(jié)抑制作用而調(diào)控蛋白質(zhì)的合成，也可以通過誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄機制的生物合成而促進蛋白質(zhì)的合成［24］。研究表明，泌乳激素單獨添加效果不明顯［25］，與氨基酸同時添加能進一步增強乳蛋白的合成，營養(yǎng)素和激素可以通過mTOR信號路徑來調(diào)控乳蛋白的合成和轉(zhuǎn)運［26－29］。INS首先激活I(lǐng)NS亞基受體從而促進乳腺上皮細胞泌乳的生物合成［30］，然后通過改變4E－BP1、轉(zhuǎn)譯抑制因子和核糖體蛋白p70S6激酶1（P70S6K1）的磷酸化狀態(tài)使mTOR信號、氨基酸供應(yīng)、細胞能量狀態(tài)和激素信號級聯(lián)融合而調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的合成，還可以通過增加乳腺血漿流速來起作用［27－28］。研究表明，在 HYD和PRL這2種激素同時存在的條件下，INS可以促進乳蛋白相關(guān)基因的表達和乳蛋白的合成，在缺乏PRL的條件下，INS對乳蛋白相關(guān)基因的表達也起著很關(guān)鍵的作用［31－32］。

表6 INS濃度（0～25.0ng/mL）與各基因表達量間的相關(guān)性分析Table 6 Correlative analysis of INS concentration（0to 25.0ng/mL）and gene expression levels

本試驗結(jié)果表明，與0ng/mL組相比，添加2.5、25.0 和 250.0ng/mL INS能 夠 顯 著 提 高PKB基因表達量；從mTOR基因表達量來看，2.5和25.0ng/mL組極顯著高于0ng/mL組，250.0ng/mL組也高于0ng/mL組，但差異不顯著，5 000.0ng/mL組極顯著低于0ng/mL組。這與前人的研究結(jié)果一致，也進一步證實了INS是通過增加激素受體表達，增加mTOR信號通路中正向調(diào)節(jié)基因表達的，促進CSN1S1基因表達進而促進乳蛋白合成，但高濃度的INS（＞5 000.0ng/mL）反而對乳蛋白合成不利。本試驗還發(fā)現(xiàn)25.0和250.0ng/mL組S－PRLR基因表達量極顯著高于0ng/mL組，5 000.0ng/mL 組 則 顯 著 高 于0ng/mL組，這說明INS不但對自身受體起作用，同時還能影響S－PRLR基因表達，進而影響乳蛋白的合成。

P70S6K1和4E－BP1是mTOR的2個直接下游靶蛋白，都是細胞蛋白質(zhì)生物合成的關(guān)鍵因子。在細胞內(nèi)，4E－BP1被mTOR磷酸化后，降低了與真核翻譯起始因子4E（eIF4E）的親和力，使eIF4E形成更多的eIF4F復(fù)合物，啟動胞內(nèi)mRNA的翻譯［33］。mTOR的活性被抑制，使4E－BP1磷酸化減少，使其與eIF4E的親和力增加，從而阻斷mRNA翻譯起始復(fù)合物的形成，進而阻斷細胞的增殖［34］。有研究表明，INS能夠減少4E－BP1含量并增加磷酸化4E－BP1含量來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄［35－37］。本試驗研究表明，對于mTOR下游4E－BP1基因表達量，2.5和 25.0ng/mL 組 極 顯 著 高 于 0ng/mL組，250.0和5 000.0ng/mL組也高于0ng/mL組，但差異不顯著，且隨著INS濃度的增加表達量呈下降趨勢。分析其原因，一方面可能是基因4E－BP1高的表達量為有更多的4E－BP1進入磷酸化狀態(tài)奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)，另一方面可能是已經(jīng)有足夠的促進CSN1S1基因表達的4E－BP1進入到磷酸化狀態(tài)而將4E－BP1富余下來，可用于進一步促進乳蛋白相關(guān)基因的表達，進而促進乳蛋白的合成，這與整體試驗結(jié)果相吻合。

表7 INS濃度（25.0～5 000.0ng/mL）與各基因表達量間的相關(guān)性分析Table 7 Correlative analysis of INS concentration（25.0to 5 000.0ng/mL）and gene expression levels

INS不僅僅是乳蛋白基因表達所必需的，還在多個層面誘導(dǎo)奶牛乳腺上皮細胞乳蛋白合成。研究表明，乳蛋白基因的表達需要INS、PRL和HYD，在164個對INS敏感的基因中，其中18個隨著氨基酸的攝取和代謝在轉(zhuǎn)錄和后轉(zhuǎn)錄水平與乳蛋白的合成密切相關(guān)［38］。單獨添加INS能夠同時促進乳蛋白和非乳蛋白的合成，但PRL單獨添加效果不明顯，二者同時添加則具有協(xié)同作用，能進一步促進乳蛋白的合成［39］。也有研究表明，在皮質(zhì)醇和PRL存在的情況下，INS在乳蛋白合成中有潛在作用，INS刺激了直接參與蛋白質(zhì)合成的28個基因的表達，其中包括4種酪蛋白基因［40］。本試驗研究結(jié)果表明，與0ng/mL組相比，添加INS能夠促進奶牛乳腺上皮細胞CSN1S1基因的表達，各INS組CSN1S1基因表達量均高于0ng/mL，其中25.0ng/mL INS作用效果最好，極顯著高于其他各組，這與前人研究結(jié)果一致。

3.2 INS對奶牛乳腺上皮細胞JAK－STAT信號通路的影響

JAK是一類非受體酪氨酸激酶家族，其中JAK2是哺乳動物JAKs家族中已發(fā)現(xiàn)的4個成員之一［41］。STAT5A是在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的JAKs的7種STAT底物之一，它在乳腺細胞增殖、分化和泌乳方面起著主要作用［42］。

激素可以和細胞膜上的激素受體結(jié)合形成復(fù)合物，激活胞內(nèi)JAK2，使激素受體上的酪氨酸殘基磷酸化，2個STATs蛋白通過各自磷酸化的酪氨酸和對方的含Src同源區(qū)2（SH2）功能域結(jié)合，形成STATs二聚體進入核內(nèi)從而激活基因的轉(zhuǎn)錄，此路徑稱為JAK－STAT信號通路［43］。有關(guān)激素與JAK－STAT信號通路的研究主要集中在一些疾病研究中，涉及到的激素主要有生長激素、PRL、雌激素等，它們的作用都是通過此途徑來發(fā)揮的［44－45］，關(guān)于INS的研究并不多見。本試驗研究結(jié)果表明，與0ng/mL組相比，INS可以顯著增加奶牛乳腺上皮細胞JAK－STAT信號通路中JAK2和STAT5 A基因表達量，其中2.5ng/mL組顯著增加了JAK2基因表達量，25.0和250.0ng/mL組則極顯著增加了JAK2基因表達量，而5 000.0ng/mL組則差異不顯著，但高于0ng/mL組；另 外，與 0ng/mL 組 相 比，2.5、25.0 和250.0ng/mL組極顯著增加了STAT5 A基因表達量，而5 000ng/mL組則差異不顯著，且低于0ng/mL組。這與前人研究結(jié)果一致，也進一步證實了JAK－STAT信號通路在奶牛乳蛋白合成中的作用，說明INS在調(diào)節(jié)mTOR信號通路的同時也調(diào)節(jié)著JAK－STAT信號通路，也是通過促進JAKSTAT信號通路中正向調(diào)節(jié)基因的表達來促進奶牛乳腺上皮細胞CSN1S1基因的表達，進而促進奶牛乳腺乳蛋白的合成，但是高濃度的INS（＞5 000.0ng/mL）可能對奶牛乳腺乳蛋白的合成不利。

通過本試驗的相關(guān)性分析表明，當INS濃度在0～25.0ng/mL時，S－PRLR 與CSN1S1基因表達量、INS濃度與S－PRLR、CSN1S1基因表達量及4E－BP1與STAT5 A基因表達量間呈顯著正相關(guān)；當INS濃度在25.0～5 000.0ng/mL時，INS濃度與JAK2基因表達量間呈顯著負相關(guān)，與S－PRLR基因表達量間呈負相關(guān)的趨勢，4E－BP1與CSN1S1基因表達量、PKB與mTOR、STAT5 A基因表達量間呈顯著正相關(guān)；當INS濃度在0～5 000.0ng/mL時，INS濃度與各基因表達量不相關(guān)，JAK2與S－PRLR基因表達量間呈顯著正相關(guān)，與CSN1S1和STAT5 A基因表達量間有呈顯著正相關(guān)的趨勢；S－PRLR與CSN1S1基因表達量間有呈顯著正相關(guān)的趨勢；STAT5 A與mTOR、4E－BP1基因表達量間呈顯著和極顯著正相關(guān)，這一結(jié)果與前面的試驗結(jié)果完全一致，也進一步證實了0～25.0ng/mL的INS可以促進信號通路中各正向調(diào)節(jié)基因的表達，而INS濃度在25.0～5 000.0ng/mL時，INS的促基因表達作用逐漸減弱，甚至抑制2條主要信號通路中各基因的表達，進而使CSN1S1基因表達量逐漸減少；這一結(jié)果也證實了INS主要是通過mTOR和JAK－STAT 2條信號通路來調(diào)節(jié)乳蛋白相關(guān)基因表達的，這可能進一步影響乳蛋白的合成。

4 結(jié) 論

①INS可以促進奶牛乳腺上皮細胞CSN1S1基因的表達。

②INS促進乳蛋白合成的作用機理可能是通過同時作用于mTOR和JAK－STAT 2條信號通路來調(diào)節(jié)乳蛋白相關(guān)基因表達進而促進乳蛋白合成的；另一方面，INS還可能通過影響PRL受體的作用而影響乳蛋白的合成。

③INS對乳蛋白合成的調(diào)控有一定的劑量依賴關(guān)系，低濃度時隨著INS濃度的增加呈正向調(diào)控的關(guān)系，總體看來，添加25.0ng/mL INS時作用效果最好，但高濃度（＞5 000.0ng/mL）的INS對奶牛乳腺乳蛋白的合成反而不利。

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