王永青，張小琴，王宇池，韓力揮

（1．中國海洋大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，山東 青島266100；2．海洋化學(xué)理論與工程技術(shù)教育部重點實驗室，山東 青島266100）

Lipstatin是一種有效的胃腸道胰脂肪酶抑制劑，是毒三素鏈霉菌（Streptomyces toxytricini）的代謝產(chǎn)物。它的氫化產(chǎn)物Orlistat，是一種重要的防治與肥胖相關(guān)疾病的藥物，不作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，副作用小。

Paul等［1］首次公布了Lipstatin的發(fā)酵生產(chǎn)工藝和提取工藝，生產(chǎn)菌種為Streptomyces toxytricini NRRL 15443，種子培養(yǎng)基391，發(fā)酵合成培養(yǎng)基N16，最高發(fā)酵效價為6．23mg·L－1。Adelbet等［2］研究了在含有合適碳源、氮源和無機(jī)鹽的液體培養(yǎng)基中用放線菌好氧發(fā)酵生產(chǎn)Lipstatin的分批補(bǔ)料生產(chǎn)工藝，培養(yǎng)基中不含脂肪酸，在發(fā)酵初期補(bǔ)亞油酸和辛酸（或其酯和鹽）以及N－甲酰基－L－亮氨酸（優(yōu)選補(bǔ)料L－亮氨酸），用抗氧化劑穩(wěn)定亞油酸，但由于脂肪酸毒性的影響以及菌種對亞油酸補(bǔ)料液的代謝能力較低，所以Lipstatin發(fā)酵效價仍很低。Varga等［3］研究了用毒三素鏈霉菌CCM7349發(fā)酵生產(chǎn)Lipstatin的工藝過程，在裝有40L不含乳化劑的培養(yǎng)基的70L發(fā)酵罐中二級發(fā)酵，發(fā)酵34h后開始補(bǔ)亞油酸和8%的L－亮氨酸溶液，28℃下培養(yǎng)180～230h，最終發(fā)酵效價為3．0～3．2g·kg－1。Gasparic等［4］研究了在含有亞油酸的種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)放線菌的發(fā)酵工藝，培養(yǎng)基中亞油酸的質(zhì)量濃度大于0．3%、豆油的質(zhì)量濃度大于1%，28℃下好氧培養(yǎng)144h，未補(bǔ)料時Lipstatin發(fā)酵效價為（556±81）mg·L－1，補(bǔ)料時發(fā)酵效價為4773mg·L－1。Fujs等［5］利用毒三素鏈霉菌的突變菌種，在含有亞油酸前體的培養(yǎng)基中發(fā)酵生產(chǎn)Lipstatin，接種后20h補(bǔ)亞油酸和L－亮氨酸，使亞油酸的濃度維持在0．3%～0．5%之間，Lipstatin的發(fā)酵效價為4400mg·L－1。

作者在前人研究的基礎(chǔ)上，研究了補(bǔ)料亞油酸對Lipstatin發(fā)酵生產(chǎn)工藝的影響，并確定了最佳的補(bǔ)料時間和補(bǔ)料速率，擬為工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)Lipstatin中亞油酸控制工藝提供依據(jù)。

1 實驗

1．1 菌種和培養(yǎng)基

菌種：毒三素鏈霉菌（Streptomyces toxytricini），本實驗室優(yōu)選。

種子培養(yǎng)基（g·L－1）：大豆粉10，甘油10，酵母膏5，亞油酸2，加自來水至1L。用10%NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7．0。121℃、0．1MPa下滅菌30min。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g·L－1）：大豆粉60，甘油30，磷脂14，CaCO32．0，消沫劑SAG 1．0，加自來水至1L。用10%NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7．0。121℃、0．1MPa下滅菌30min。

1．2 試劑與儀器

亞油酸，青島澳海生物有限公司。

反相 HPLC1100型色譜儀，Agilent公司；PHS－3C型精密pH計。

1．3 發(fā)酵培養(yǎng)方法

搖瓶種子培養(yǎng)：用無菌水刮洗下斜面菌體，制成菌懸液。取1mL菌懸液接入裝有100mL種子培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，置于旋轉(zhuǎn)式搖床27℃、210r·min－1下振蕩培養(yǎng)24～36h。

發(fā)酵培養(yǎng)：10L發(fā)酵罐中培養(yǎng)基裝量為6L，接種量10%，27℃、轉(zhuǎn)速450r·min－1，通氣1VVm，培養(yǎng)144h。

1．4 分析測試

發(fā)酵液pH值：采用精密pH計測定。

菌體濃度（濕菌體量，PMV）：采用濕重法測定，取發(fā)酵液置于10mL離心管中，離心（3500r·min－1，10 min），棄上清，以沉降的固體體積占總發(fā)酵液體積的百分?jǐn)?shù)為PMV。

發(fā)酵液的處理及Lipstatin效價：取10mL發(fā)酵液離心（3800r· min－1，10min），上清液用丙酮以1∶4的比例搖勻浸泡2h后再次離心（10 000r· min－1，3min），取上清液進(jìn)行HPLC分析，測定發(fā)酵液的胞外效價；并用同樣的方法測定菌絲體沉淀中的產(chǎn)物量（胞內(nèi)效價）。發(fā)酵液總效價為胞內(nèi)效價和胞外效價之和［6］。

HPLC色譜條件：自動進(jìn)樣器，DAD檢測，色譜柱為反相Inertsil C18柱（4．0mm×150mm，3μm）；檢測波長200nm；流動相為乙腈－0．1%H3PO4溶液（75∶25）；柱溫45℃；流速1．5mL· min－1。

2 結(jié)果與討論

2．1 發(fā)酵培養(yǎng)基中初始亞油酸濃度對產(chǎn)Lipstatin的影響

在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入亞油酸，濃度（g·L－1）分別為0、10、20、30、40、50，考察初始亞油酸濃度對產(chǎn)Lipstatin的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 初始亞油酸濃度對菌體濃度（a）和Lipstatin發(fā)酵效價（b）的影響Fig．1 The effects of initial concentration of linoleic acid on mycelium concentration（a）and lipstatin titer（b）

由圖1a可知，適量的亞油酸對菌種生長有明顯的促進(jìn)作用，但若過量則對菌種生長產(chǎn)生抑制作用，這可能是因為亞油酸的毒性所致。當(dāng)初始亞油酸濃度為30g·L－1時，菌體生長量最大。

由圖1b可知，在Lipstatin的生物合成過程中添加一定量的亞油酸是必要的，它對Lipstatin的生成有明顯的促進(jìn)作用，可使Lipstatin的合成時間提前，培養(yǎng)基中添加20g·L－1的亞油酸效果最好，Lipstatin的發(fā)酵效價達(dá)到6．2g·L－1。

2．2 補(bǔ)料時間對產(chǎn)Lipstatin的影響

在含有20g·L－1亞油酸的發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別在接種后發(fā)酵12h、24h、36h、48h、60h和72h開始補(bǔ)亞油酸，補(bǔ)料速率為0．3g·L－1·h－1，考察補(bǔ)料時間對Lipstatin發(fā)酵效價的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 補(bǔ)料時間對Lipstatin發(fā)酵效價的影響Fig．2 The effect of feeding time on lipstatin titer

由圖2可知，在接種后36h開始補(bǔ)料，發(fā)酵效價最高。這可能是因為，培養(yǎng)36h時菌體生長進(jìn)入穩(wěn)定期，Lipstatin開始大量合成，而亞油酸又是Lipstatin合成過程中重要的前體物質(zhì)，故36h時補(bǔ)料對合成有明顯促進(jìn)作用。

2．3 補(bǔ)料速率對產(chǎn)Lipstatin的影響

控制補(bǔ)料速率（g·L－1·h－1）分別為0．1、0．2、0．3、0．35、0．4、0．5，其它條件不變，考察補(bǔ)料速率對Lipstatin發(fā)酵效價的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 補(bǔ)料速率對Lipstatin發(fā)酵效價的影響Fig．3 The effect of feeding rate on lipstatin titer

由圖3可知，當(dāng)補(bǔ)料速率為0．35g·L－1·h－1時，Lipstatin的發(fā)酵效價最高，為6．8g·L－1。

3 結(jié)論

亞油酸作為Lipstatin生物合成的前體物質(zhì)，對Lipstatin的發(fā)酵有重要影響。在初始亞油酸濃度為20g·L－1的發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種后發(fā)酵36h開始補(bǔ)料、補(bǔ)料速率為0．35g·L－1·h－1時，Lipstatin的發(fā)酵效價最高，為6．8g·L－1。

［1］Paul H，Erich H，Ernst K，et al．Leucine derivatives［P］．EP 129 748，1985－01－02．

［2］Adelbet B，Peter S，Wolfgang W．Process for the production of lipstatin and tetrahydrolipstatin［P］．EP 0 803 576A2，1997－10－29．

［3］Varga I，Gondova B，Gajdosikova J，et al．The strain Streptomyces toxytricini lipstatin－producing microorganism and preparation of lipstatin with inscribed strain［P］．WO 2007 078 263A2，2007－07－12．

［4］Gasparic A，Svageli N B，Raspor P，et al．Fermentative production of lipstatin［P］．EP 1 860 194A1，2007－11－28．

［5］Fujs S，Kuscer E，Petkovic H，et al．Process for production of lipstatin and microorganisms therefore［P］．WO 2010 000 839A1，2010－01－07．

［6］茆永康，陳代杰，黃為一．表面活性劑PEG600對毒三素鏈霉菌發(fā)酵的影響［J］．中國抗生素雜志，2005，30（11）：649－652．