鄭建輝，張炫輝，李國琴，鄧 悅，陳曉萍，李國華

（1．浙江工業(yè)大學生物與環(huán)境工程學院，浙江 杭州310014；2．浙江工業(yè)大學化學工程與材料學院，浙江 杭州310014）

生物材料的血液相容性標準于20世紀60年代首先由美國國立衛(wèi)生研究院建立，主要用于評價生物材料植入體內(nèi)后血液成分對其的適應性［1］。血液相容性評價包括溶血和凝血性質(zhì)兩方面［2］。溶血是指紅細胞溶解、血紅蛋白釋放的現(xiàn)象，而凝血是指血漿凝固的過程，涉及到多種血漿成分、血小板、血管內(nèi)皮細胞。當一種生物材料與血液接觸時，其表面的理化性質(zhì)以及形貌特征是影響血液相容性的主要因素［3－5］。

TiO2納米顆粒具有獨特的物理、化學與生物特性，在化妝品、食品、醫(yī)藥領域有著潛在的廣泛應用前景。因此，近年來其生物相容性受到越來越多的關注。血液是機體的運輸系統(tǒng)，血液相容性是生物相容性評價的重要環(huán)節(jié)，根據(jù)文獻報道，TiO2納米顆?？梢鹧毎练e、血液凝集以及紅細胞溶血［6］，這種血液特性與 TiO2納米顆粒的表面特征有關［7，8］。

作者在此對自制金紅石TiO2納米顆粒與市售P25TiO2納米顆粒進行結構表征，然后采用兩種常規(guī)的血液相容性研究方法——紅細胞溶血實驗與血漿復鈣時間（PRT）測定，分析比較了這兩種TiO2納米顆粒的血液相容性特點。

1 實驗

1．1 試劑與儀器

四氯化鈦（98．0%），上海美星化工試劑有限公司；P25TiO2納米顆粒，德國Degussa公司；新鮮綿羊抗凝血，金華利民檢驗試劑經(jīng)營部。

X′Pert PRO型 X－射線衍射儀，荷蘭PANalytical公司；Tecnai G2F30S－Twin型300kV高分辨透射電鏡，荷蘭Philips－FEI公司；UV1000型紫外可見分光光度計，上海天美科學儀器有限公司。

1．2 金紅石TiO2納米顆粒的制備

利用自有專利技術（ZL200410084338．6）采用水凝膠方法制備金紅石TiO2納米顆粒，具體過程如下：首先于0～10℃將100mL四氯化鈦液體緩慢滴入200mL去離子水中，充分攪拌混勻后形成淺黃綠色溶膠；溶膠在室溫下放置老化24～48h后，取50mL溶膠放入三角燒瓶，在0～40℃下滴加去離子水，充分攪拌形成無色透明溶液；所得溶液于40℃繼續(xù)攪拌0．5～1h，升溫至60℃維持0．5～1h，最后將體系升溫至95℃，攪拌回流2h后靜置沉淀；過濾，沉淀物經(jīng)去離子水洗滌、80℃干燥，即得金紅石TiO2納米顆粒。

1．3 納米材料的結構表征

X－射線衍射測試采用 Cuκα 射線（λ＝0．1541 nm），電壓40kV，電流40mA，步長0．033°，范圍20°～75°；HRTEM微結構表征采用高分辨透射電鏡。在進行HRTEM測試之前，將樣品超聲分散在無水乙醇中，吸取上清液滴至Cu網(wǎng)，干燥。

1．4 血漿復鈣時間的測定

血漿復鈣時間的測定參照文獻［9，10］。具體步驟如下：（1）取10mL新鮮綿羊抗凝血，以3000r·min－1離心20min，小心吸取上清液，即為乏血小板血漿（Platelet－poor plasma，PPP）；（2）以生理鹽水將金紅石與P25TiO2納米顆粒配成20mg·mL－1的懸液，超聲分散1h，121℃ 滅菌30min得納米儲備液；（3）以生理鹽水將金紅石和P25納米儲備液配成0mg·mL－1、1mg·mL－1、2mg·mL－1、3mg·mL－1、4mg·mL－1、5mg·mL－1、6mg·mL－1的溶液，超聲分散1h，得納米懸浮液；（4）將納米懸浮液以2500r·min－1離心10min，吸取上清液，得納米浸出液；（5）取2．5cm×7．5cm潔凈載玻片，加入100μL PPP、100 μL納米懸浮液或浸出液、100μL 0．025mol·mL－1CaCl2溶液，混勻，37℃孵育，立即計時，每隔30s以不銹鋼注射器針頭挑動混合液，當針頭上出現(xiàn)纖維沉淀時停止計時，即為血漿復鈣時間。

1．5 紅細胞溶血實驗

通過檢測靜態(tài)條件下紅細胞中血紅蛋白的釋放評價紅細胞溶血程度［11］。具體步驟如下：（1）取新鮮綿羊抗凝血6mL置于10mL離心管中，以2500r·min－1離心10min，棄上清液。沉淀的紅細胞用生理鹽水反復洗滌2～3次，至離心后上清液無色。將所得的紅細胞用生理鹽水配成2%的紅細胞懸液，現(xiàn)配現(xiàn)用，使用時搖勻；（2）將金紅石與P25納米儲備液以生理鹽水配成0mg·mL－1、0．4mg·mL－1、0．8mg·mL－1、1mg·mL－1、2mg·mL－1、3mg·mL－1、4mg·mL－1的納米使用液，取2mL納米使用液，加入2mL紅細胞懸液，混勻后成為溶血測試液；（3）溶血測試液分別進行紫外激發(fā)和無紫外激發(fā)兩種處理。紫外激發(fā)組溶血測試液先用波長280nm的紫外燈照射2h，然后放入37℃的電熱恒溫水浴鍋中孵育4h。無紫外激發(fā)組溶血測試液先于室溫下靜置2h，再和紫外激發(fā)組一起于37℃孵育4h。孵育后的溶液以2500r·min－1離心10min，小心吸取上清液，用紫外可見分光光度計測定545nm波長下的吸光度，測定時用生理鹽水調(diào)零，以去離子水加等量紅細胞懸液作為陽性對照；（4）溶血率計算公式：溶血率＝（樣品管OD值／陽性對照管OD值）×100%。

1．6 統(tǒng)計學處理

定量測定中每個樣本重復測定5次，實驗數(shù)據(jù)以（均數(shù)±標準誤差）表示，t－Student方法進行顯著性檢驗，以P＜0．05為顯著性差異、P＜0．01為非常顯著性差異。

2 結果與討論

2．1 金紅石與P25TiO2納米顆粒的XRD分析（圖1）

圖1 金紅石和P25TiO2納米顆粒的XRD圖譜Fig．1 XRD Patterns of rutile and P25TiO2nanoparticles

從圖1可以看出，金紅石TiO2納米顆粒在衍射角2θ＝27．446°、d＝0．3247nm處出現(xiàn)最明顯的衍射峰，其次分別在2θ＝36．085°、d＝0．2487nm 和2θ＝54．322°、d＝0．1687nm 處出現(xiàn)較明顯的衍射峰，分別屬于金紅石相的（101）、（110）、（211）晶面（PDF＃21－1276）。表明所制備的納米TiO2晶型為純金紅石相。P25TiO2納米顆粒在2θ＝25．281°、d＝0．352nm（PDF＃21－1272）和2θ＝27．446°、d＝0．3247nm處有較明顯的衍射峰，但銳鈦礦相的衍射峰峰面積比金紅石相的大，證實其組成為80%～75%銳鈦礦相和20%～25%金紅石相。

2．2 金紅石與P25TiO2納米顆粒的HRTEM分析

圖2為兩種TiO2納米顆粒的高分辨透射電鏡（HRTEM）照片。

從圖2a、b可以看出，金紅石TiO2納米顆粒呈多面體形狀，粒徑20～60nm，其晶格條紋清晰，相鄰的晶格間距為0．32nm，與金紅石相的主晶面（101）（0．3247nm，PDF＃077－0441）接近。從圖2c可以看出，P25TiO2納米顆粒也呈多面體形狀，粒徑15～50 nm，與金紅石TiO2納米顆粒相近，但P25的晶形不如金紅石規(guī)整，粒徑分布較廣，這可能是由于晶體的多面體畸變程度以及相互連接方式不同所致。

2．3 金紅石與P25TiO2納米顆粒對血漿凝集的影響

金紅石與P25TiO2納米顆粒對血漿復鈣時間的影響見圖3。

從圖3可以看出，在0．4～4．0mg·mL－1范圍內(nèi)，無論是采用懸浮液還是浸出液，兩種TiO2納米顆粒都沒有引起血漿復鈣時間的改變，相互之間也沒有顯著的差異（P＞0．05）。表明金紅石與P25TiO2納米顆粒對血漿凝集無明顯影響。

2．4 金紅石與P25TiO2納米顆粒對紅細胞溶血活性的影響

金紅石與P25兩種TiO2納米顆粒對紅細胞溶血活性的影響如圖4所示。

圖4 金紅石（a）和P25（b）TiO2納米顆粒對紅細胞溶血活性的影響Fig．4 Effects of rutile（a）and P25（b）TiO2nanoparticles on hemolytic activity

從圖4可以看出，在低劑量（≤0．8mg·mL－1）作用下，兩種TiO2納米顆粒對紅細胞溶血率無明顯影響（P＞0．05）；當作用劑量為1．0～4．0mg·mL－1時，如不經(jīng)紫外線激發(fā)，金紅石與P25TiO2納米顆粒對紅細胞溶血活性仍無明顯影響，但經(jīng)紫外線處理后的TiO2納米顆粒引起了輕度的紅細胞溶血。

2．5 討論

關于TiO2納米顆粒的血液相容性近年來受到了許多關注，多數(shù)文獻認為，納米TiO2是生物安全度高的生物材料，如使用超疏水TiO2納米管進行體外實驗未引起明顯的溶血現(xiàn)象［11］；陳效等［12］用 TiO2納米溶膠進行體外實驗也未引起溶血現(xiàn)象，通過尾靜脈注射TiO2納米顆粒到小鼠體內(nèi)，凝血時間無明顯改變；但Li等［6］在以TiO2納米顆粒與紅細胞共孵育后，發(fā)現(xiàn)納米顆粒引起紅細胞聚集與沉淀，并出現(xiàn)輕度溶血。

TiO2納米顆粒的表面特性會影響其血液相容性，如覆蓋于拋光Ti表面的網(wǎng)絡狀TiO2納米顆粒誘導血小板聚集與活化［8］，表面包覆TiO2的鎳鈦合金導致血液凝集能力降低［13］，摻Gd3＋的無定形TiO2納米顆粒具有較高的生物相容性［14］，摻磷的金紅石TiO2晶體的血液相容性得到改善［15］，摻磷納米TiO2薄膜的血液相容性也發(fā)生了改變［16］。

本研究用TiCl4制備的金紅石TiO2納米顆粒與P25TiO2納米顆粒粒徑相近，但純度、晶體規(guī)整性與粒徑均勻度不同。從紅細胞溶血和凝血實驗來看，兩種納米顆粒僅在高濃度作用同時伴有紫外激活條件下才會引起溶血率輕度升高，對血漿復鈣時間沒有明顯的影響。由于納米材料的生物相容性涉及敏感的生態(tài)安全性問題，對這種輕微溶血現(xiàn)象仍需加以進一步的關注。

3 結論

不同TiO2納米顆粒的血液相容性具有差別。采用高分辨透射電鏡和X－射線衍射儀對自制金紅石TiO2納米顆粒和市售P25TiO2納米顆粒進行結構表征，并研究了這兩種納米顆粒對紅細胞溶血活性與血漿復鈣時間的影響。結果表明，兩種TiO2納米顆粒都具有很好的血液相容性，在一定劑量范圍內(nèi)不引起紅細胞溶血和凝血現(xiàn)象，但金紅石與P25TiO2納米顆粒在濃度大于1．0mg·mL－1的高劑量下伴以紫外線激發(fā)后可造成輕微的溶血現(xiàn)象。這種輕微溶血現(xiàn)象需引起納米材料生物相容性評價的關注。

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