周佳琦，盧佳睿，徐 花，韓 放，孫延波

（吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系，吉林 長春 130021）

＊吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)七年制2008級

自抗菌素問世以來，各種感染性疾病所造成的多種急重癥的治療已不再是難題，然而，抗生素的不合理使用所引起的細菌耐藥性問題日益突出。細菌對氨基糖苷類抗菌素的耐藥是由于細菌產(chǎn)生氨基糖苷類修飾酶（aminoglycoside modifying enzyme，AME）以及氨基糖苷類藥物的作用靶位16SrRNA的基因突變［1］。2006年初，美國學(xué)者 Robicsek等［2］發(fā)現(xiàn)了不僅對氨基糖苷類藥物有修飾作用，而且對喹諾酮類藥物也有修飾作用的新氨基糖苷類修飾酶aac（6′）－Ⅰb－Cr型。國內(nèi)雖有對 AME基因的研究［3－4］，但未見有關(guān)長春地區(qū)的文獻報道。腸桿菌科細菌和某些非發(fā)酵革蘭陰性桿菌是造成醫(yī)院感染重要的致病菌［5－6］，因此，為了解本地區(qū)革蘭陰性桿菌中AME基因存在狀況，本文作者對從臨床分離的69株革蘭陰性桿菌進行了藥敏試驗，并檢測了6種 AME 基因，即aac（3）－Ⅰ、aac（3）－Ⅱ、aac（6′）－Ⅰ b、aac（6′）－Ⅱ、ant（3"）－Ⅰ 和ant（2"）－Ⅰ。

1 材料與方法

1.1 菌株和藥品 69株革蘭陰性桿菌來自長春地區(qū)部分醫(yī)院檢驗科，包括大腸埃希菌（Escherichia coli）31株，鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumannii）15株，肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）11株，陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）12株。上述菌株經(jīng)法國生物梅里埃公司VITEK－32全自動微生物分析系統(tǒng)鑒定。阿米卡星由中國藥品生物制品檢定所提供，批號：130335－200204。慶大霉素由北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司提供，批號：1B310330。

1.2 藥敏試驗 采用瓊脂稀釋法測定69株革蘭陰性桿菌對阿米卡星和慶大霉素的敏感性，在藥物濃度超過16mg·L－1時，細菌仍生長判定為耐藥，介于2～8mg·L－1為中介，低于2mg·L－1為敏感。

1.3 細菌處理 取菌液1mL置于1.5mL離心管，10000r·min－1離心1min，棄上清加入100μL TE Buffer（1mol·L－1Tris－HCl pH 8.0，500mmol·L－1EDTA pH 8.0），加入等體積酚／氯仿／異戊醇（25∶24∶1），渦旋震蕩 30s，10000r·min－1離心5min，上清液即為基因檢測的模板，－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 AME基因的引物設(shè)計及檢測 根據(jù)GenBank發(fā)布的各型AME基因序列自行設(shè)計引物，6種靶基因引物序列和產(chǎn)物長度見表1。聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴增體系：P1、P2引物各1μL（0.4μmol·L－1），Premix Taq 13μL（Taq DNA poL 1.25U·25μL－1，dNTPs 0.4mmol·L－1，PCR buffer），ddH2O 9μL，模板1μL，反應(yīng)體系25μL。PCR產(chǎn)物長度＞500bp的PCR反應(yīng)條件：93℃ 初始變性2min；93℃ 變性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min；35個循環(huán)，72℃最后延伸5min。PCR產(chǎn)物長度＜500bp的PCR反應(yīng)條件：93℃初始變性5min；93℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min；35個循環(huán)，72℃最后延伸5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2% 瓊脂糖凝膠電泳后，用凝膠成像儀觀察結(jié)果。

1.5 PCR產(chǎn)物測序 PCR產(chǎn)物送至北京六合華大基因科技股份有限公司測序，利用Chromas讀序軟件將測得序列與GenBank發(fā)布的序列進行比對。

2 結(jié) 果

2.1 藥敏試驗結(jié)果 69株革蘭陰性桿菌中有16株大腸埃希菌、1株肺炎克雷伯菌、3株陰溝腸桿菌和11株鮑曼不動桿菌對阿米卡星呈現(xiàn)耐藥，即最低抑菌濃度超過16mg·L－1（表2）。慶大霉素的耐藥試驗顯示：26株大腸埃希菌、11株肺炎克雷伯菌、8株陰溝腸桿菌和15株鮑曼不動桿菌呈現(xiàn)耐藥（表3）。

2.2 AME基因檢測結(jié)果 在69株革蘭陰性桿菌中檢 出 aac（3）－Ⅰ、aac（3）－Ⅱ、aac（6′）－Ⅰb、ant（3"）－Ⅰ和ant（2"）－Ⅰ基因，其陽性株數(shù)分別為3（4.3%）、56（81.2%）、30（43.5%）、23（33.3%）和9（13.0%），而aac（6′）－Ⅱ基因為陰性（表4）。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)：1株鮑曼不動桿菌同時攜帶4種AME基因，15株細菌（5株鮑曼不動桿菌、3株陰溝腸桿菌、5株大腸埃希菌和2株肺炎克雷伯菌）同時攜帶3種基因，25株（5株鮑曼不動桿菌、3株陰溝腸桿菌、11株大腸埃希菌和6株肺炎克雷伯菌）同時攜帶2種基因（表5）。22株細菌僅1種基因陽性，其余6株未檢出任何1種基因。5種AME基因的PCR擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖1。

表3 革蘭陰性桿菌對慶大霉素的藥敏率Tab.3 The susceptibilities of gram－negative bacilli to gentamicin ［n（η／%）］

2.3 AME基因序列分析 5種AME基因測序結(jié)果見圖2～6。測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫比對，序列完全一致。

表4 AME基因檢測結(jié)果Tab.4 The detection results of AME gene ［n（η／%）］

表5 AME基因組合形式Tab.5 The combination form of AME gene

3 討 論

氨基糖苷類抗生素（aminoglycosides）是由氨基糖與氨基環(huán)醇連接而成的氨基糖苷類抗生素，可來自鏈霉菌的鏈霉素和小單孢菌的慶大霉素等天然氨基糖苷類。氨基糖苷類抗生素通過與細菌核糖體30S亞基的16SrRNA的A位解碼區(qū)核苷酸形成氫鍵，干擾細菌蛋白質(zhì)的合成，從而發(fā)揮抗菌作用。

圖2 aac（3）－Ⅰ基因測序圖Fig.2 Sequencing diagram of aac（3）－Ⅰ gene

圖3 aac（3）－Ⅱ基因測序圖Fig.3 Sequencing diagram of aac（3）－Ⅱ gene

自1944年首次發(fā)現(xiàn)鏈霉素以來，因此類藥物抗菌譜廣、療效卓越，在醫(yī)學(xué)臨床和畜牧獸醫(yī)業(yè)得到廣泛應(yīng)用。但由于逐年泛用和過度使用，各種細菌對氨基糖苷類抗菌素耐藥問題也日益嚴(yán)重，細菌對該類抗生素耐藥可通過酶修飾、細胞膜滲透性改變、外排泵活性、phoP－phoQ系統(tǒng)和16SrRNA甲基化酶等機制［5－7］來實現(xiàn)。在所有機制中，質(zhì)粒或染色體介導(dǎo)的AME是最普遍的。AME由質(zhì)?；蛉旧w編碼，通常由可移動DNA片段攜帶，質(zhì)粒的交換和轉(zhuǎn)座子作用均有利于耐藥基因滲入到敏感菌株［8］。這些修飾酶包括乙酰轉(zhuǎn)移酶（AAC）、磷酸轉(zhuǎn)移酶（APH）和核苷轉(zhuǎn)移酶（ANT）3類［9－11］。目前已發(fā)現(xiàn)的編碼AME的基因已有30余種，在革蘭陰性桿菌中常見的有10種，除本文作者檢測的6種外，還有aac（3）－Ⅲ、aac（3）－Ⅳ、aac（6′）－Ⅰ和aph（3′）－Ⅵ［12］。這些耐藥基因經(jīng)常借助可移動性元件如質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子和整合子等在同種或不同種細菌間傳播［13－14］。

圖4 aac（6′）－Ⅰ b基因測序圖Fig.4 Sequencing diagram of aac（6′）－Ⅰ b gene

圖5 ant（3"）－Ⅰ基因測序圖Fig.5 Sequencing diagram of ant（3"）－Ⅰ gene

圖6 ant（2"）－Ⅰ基因測序圖Fig.6 Sequencing diagram of ant（2"）－Ⅰ gene

本研究分離的革蘭陰性桿菌對阿米卡星與慶大霉素的耐藥率分別為44.9%和87.0%，除肺炎克雷伯菌與陰溝桿菌對阿米卡星耐藥率稍低（9.1%、25.0%），余者對這2種抗生素的耐藥率均高于50%，說明革蘭陰性桿菌對氨基糖苷類抗生素耐藥率已經(jīng)很高。在69株細菌中有63株檢測出AME基因，占91.3%，說明革蘭陰性桿菌攜帶氨基糖苷類耐藥基因較為嚴(yán)重，與耐藥表型相符。本研究中AME基因陽性率較高并居前3位的分別為aac（3）－Ⅱ（81.2%）、aac（6′）－Ⅰ b（43.5%）和ant（3"）－Ⅰ（33.3%）；有41 株 （59.4%）的菌株攜帶2種及以上的修飾酶基因，多種耐藥基因的組合在細菌對氨基糖苷類抗生素耐藥機制中發(fā)揮了重要作用。攜帶2種及以上的修飾酶基因中也是aac（3）－Ⅱ比例最高，這種修飾酶基因的存在顯然與菌株對氨基糖苷類抗生素的高水平耐藥密切相關(guān)。9株敏感菌株中2株檢測出ant（2"）－Ⅰ，1株檢測出aac（3）－Ⅱ，原因可能是與AME基因表達強弱或者無表達有關(guān)，耐藥基因盒的表達不僅依賴于啟動子的強弱，而且與啟動子的距離遠近有關(guān)；上游基因表達強，下游基因表達弱甚至可能不表達［15］，有待進一步研究。同時，攜帶aac基因盒和碳青霉烯酶的整合子將會使細菌耐藥問題越來越嚴(yán)重［16－17］，本研究中檢出率最高的是aac（3）－Ⅱ基因，值得高度關(guān)注。抗生素泛用和濫用是導(dǎo)致相關(guān)耐藥基因傳播的重要原因，因此臨床上要注意合理使用抗生素。

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