李 玲 遲德富 裴永強 張 振 張 琦 王廣利 李小燦

(東北林業(yè)大學，哈爾濱，150040)

青楊脊虎天牛(Xylotrechus rusticus L.)屬鞘翅目天?？?，是東北林區(qū)的主要蛀干害蟲之一，其幼蟲鉆蛀樹木的枝干或根部，使輸導組織遭到破壞，影響樹木正常生長發(fā)育，甚至導致樹木風折死亡。目前利用一般的殺蟲劑防治蛀干害蟲很難達到理想的防治效果［1］。隨著青楊脊虎天牛危害的不斷加劇，對其進行有效地防控已迫在眉睫。研究表明，植物釋放的特定揮發(fā)性氣味物質能夠誘導昆蟲定位寄主、選擇適宜的產卵場所或對植物產生逃避行為。如果沒有植物氣味的存在，多數(shù)植食性昆蟲找到寄主植物的概率就會非常低，將直接影響這些種類昆蟲的生存繁衍［2］。此外，植物揮發(fā)性氣味組分可因植物的年齡、組織器官、生理狀態(tài)等的不同而改變，從而引起昆蟲的行為變化，有時微生物也參與其中。植物揮發(fā)性氣味的組成常因遭受害蟲的為害而改變［3］。所以利用植物源揮發(fā)性物質制備相應的引誘劑與驅避劑顯得尤為重要。近年來，國內對鱗翅目昆蟲感覺氣味物質的行為化學模式的研究較多，以研究棉鈴蟲取食和產卵所感知的化學信息較為深入［4］，對鞘翅目天?？评ハx尋找寄主的化學指紋圖的研究也日漸興起，但目前只是取得階段性成果，對青楊脊虎天牛信息素和其寄主植物次生代謝產物的研究也漸趨深入［5－8］。筆者通過對青楊脊虎天牛蛀屑及被害的小青黑楊((P.pseudo-simonii×P.nigra))樹皮揮發(fā)物質的鑒定，選擇其中的6種單體化合物及其2種混合物來研究它們與青楊脊虎天牛尋找寄主的行為關系，以期為探尋青楊脊虎天牛的寄主定位機制和生產實踐中的防治工作提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

青楊脊虎天牛成蟲:2008年2月在哈爾濱市呼蘭區(qū)，采集1～2 m長的攜帶青楊脊虎天牛幼蟲的小青黑楊木段，并將木段兩端用石蠟封好，防止木段中的水分蒸發(fā)。然后將木段置于養(yǎng)蟲室內用紗網罩上進行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為:溫度25～28℃;相對濕度50% ～70%;光照時間14 h/d。待成蟲羽化后，每天8:00收集成蟲。

蟲蛀屑:試驗分析所用的蟲蛀屑包括前1 a危害的陳蛀屑和當年危害的新蛀屑。陳蛀屑的采集是根據(jù)成蟲羽化孔位置尋找到危害部位，剝去前1 a危害部位的樹皮，采集樹皮下面的褐色至深褐色的蟲蛀屑(代號為1)。新蛀屑的采集是撥開正被危害部位的楊樹樹皮，采集白色至淡黃色的蟲蛀屑(代號為2)。

寄主樹皮:取已經被害過的小青黑楊，且有羽化孔留在表面的樹皮，去掉木栓層后留下的部分(代號為3)。

1.2 儀器設備

水蒸氣蒸餾裝置;旋轉蒸發(fā)儀(RE－52B);HP6890/5973型氣相色譜—質譜聯(lián)用儀(GC－MS)(Agilent公司);荷蘭Syntech公司觸角電位儀;“Y”形雙向選擇嗅覺儀(自制)。

1.3 所用試劑

二氯甲烷、正己烷和乙醚均為分析純。供試的6種揮發(fā)性物質和2種混合物(表1)均配制成10－5、10－4、10－3、10－2、10－1、1 g·L－16 個梯度。

表1 供試揮發(fā)物的名稱、純度、溶劑及來源

1.4 揮發(fā)物提取方法

直接浸提法:參照水浴浸提法［9－10］，浸提試劑由95%乙醇改為二氯甲烷、在室溫下浸提。將陳蛀屑、新蛀屑和樹皮各10 g分別裝入250 mL的三角瓶中，用150 mL二氯甲烷浸提24 h后過濾得Z1、Z2和Z33種提取液。另取10 g陳蛀屑用150 mL乙醚直接浸提得 Y1。

26℃水浴浸提法:參照水浴浸提法［9］。浸提試劑由95%乙醇改為水、在26℃水浴中浸提。將陳蛀屑、新蛀屑和樹皮各10 g分別裝入250 mL的三角瓶中，各加水250 mL，放入26℃水浴中浸提24 h后過濾得到3種粗提液，將3種粗提液分別用120 mL的二氯甲烷萃取，每次30 mL，萃取4次，得到E1、E2、E3提取液。

水蒸氣蒸餾法:參照王廣利的方法［8］，將陳蛀屑、新蛀屑和樹皮各10 g分別置于1 000 mL的圓底燒瓶中，加入400 mL的蒸餾水蒸餾至得到200 mL蒸餾液時止，得到3種粗提液。將3種粗提液分別用120 mL的二氯甲烷萃取，每次30 mL，萃取4次，得到S1、S2、S3提取液。陳蛀屑蒸餾液再用正己烷萃取，得到提取液W1。

3種提取方法共獲得11種提取液，分別加入無水硫酸鈉干燥、過濾;濾液分別在40℃水浴中經旋轉蒸發(fā)器濃縮至1.0 mL，備用。

1.5 GC-MS分析

彈性石英毛細管柱(25 m×200 μm×0.33 μm)。升溫程序:初始溫度50℃，保持1 min，8℃·min－1升至120℃保留5 min，10℃·min－1升至220℃保留10 min。氣化室溫度為280℃，載氣為氦氣，流速1 mL/min，無分流進樣，進樣量1 μL。電離源為EI，電子能量70 eV，離子源溫度230℃，掃描范圍30～500質量單位。揮發(fā)性物質經GC－MS分析后，所得質譜圖譜利用計算機標準質譜圖庫(NIST98)并輔助以人工識別確定化合物，以質譜離子峰面積百分數(shù)表示各成分相對含量［5，8，11－13］。

1.6 觸角電位反應

觸角電位測定刺激氣流流速、持續(xù)氣流均設定為 400 mL·min－1，刺激時間0.5 s，2 次刺激間隔30 ～60 s，以保證觸角的活性完全恢復為準。將剪成2.0 cm×0.5 cm的定性濾紙紙條折成“之”字形作為各溶液的載體，待系統(tǒng)平穩(wěn)后測試。觸角與氣味混合管的出氣管相距1 cm。以溶解各單體相應的溶劑為對照;測定青楊脊虎天牛對同種化合物、不同劑量的EAG反應時，刺激順序按質量濃度由低到高進行。在進行EAG試驗時，雌、雄成蟲的觸角隨機使用，不區(qū)分背、腹面。各種測定同個觸角連續(xù)重復3次。以相應的溶劑為對照［14－15］。

1.7 青楊脊虎天牛行為反應

參照嚴善春等［15］、Bertschy 等［16］的方法。將青楊脊虎天牛成蟲放在“Y”型管基部，待前一頭蟲前行4～5 cm后放入另一頭。觀察成蟲的行為反應。1 min內進入某一臂，定為對這一側有趨性，進入與氣味源相連接的一臂記作蟲體對氣味源有趨向性或正趨向性，未進入與氣味源相連接的一臂記作蟲體對氣味源無趨向性或有負趨向性，未進入兩臂的記作無反應。每種單體揮發(fā)物測試6次重復，每個重復10頭蟲。更換不同氣味源時，徹底清洗整個裝置。驅避率、誘集率及反應率的計算方法見參考文獻［14－15］。

1.8 數(shù)據(jù)分析

用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對試驗數(shù)據(jù)進行方差分析和多重比較［14，17－19］。

2 結果與分析

2.1 青楊脊虎天牛蛀屑和寄主樹皮揮發(fā)物的鑒定

提取并濃縮后的 Z1、Z2、Z3、E1、E2、E3、S1、S2、S3、W1和Y1提取物，經 GC－MS分析后，用計算機標準質譜圖庫和人工識別后確定的化合物種類及其相對含量，見表2。直接浸提、26℃水浴浸提和水蒸氣蒸餾3種方法共分離鑒定出92種揮發(fā)物。陳蛀屑、新蛀屑、寄主楊樹樹皮中提取的共有組分有12種即:甲苯、己醛、乙苯、對二甲苯、苯乙烯、2－丁氧基乙醇、3－丁氧基－2－丙醇、2－乙基－2－己烯－1－醇、苯甲酸乙酯、甘菊環(huán)、2，6－二叔丁基對甲基苯酚、1，2－苯二甲酸二丁酯。新蛀屑中特異性的化學組分只有甲基丙烯酸甲酯、乙二酸二甲酯2種;陳蛀屑和樹皮中的特異性化學組分較多，而陳蛀屑中又以大分子的甾醇類偏多。陳蛀屑和新蛀屑有4種共有成分，即:己醛、乙苯、2－丁氧基乙醇和2－羥基苯甲醛;新蛀屑和樹皮有4種共有成分，即:苯乙烯、3－丁氧基－2－丙醇、2－丁氧基乙醇和2－羥基苯甲醛。

表2 青楊脊虎天牛蛀屑和楊樹皮揮發(fā)物的GC－MS分析結果 %

續(xù)(表2)

2.2 不同提取方法和萃取劑提取效果的差異

采用水蒸氣蒸餾法、26℃水浴提取法和直接浸提3種方法，獲得的物質種類和數(shù)量均不相同。二氯甲烷直接浸提法獲得的揮發(fā)物種類較少，只有17種。水蒸氣蒸餾法得到37種揮發(fā)物質。26℃水浴提取法提取揮發(fā)物數(shù)量與水蒸氣蒸餾法相近，得到34種揮發(fā)物，而且26℃水浴提取法是常溫提取法，提取溫度與青楊脊虎天牛羽化時的自然溫度接近，獲得的物質可能更接近自然揮發(fā)的組分。

采用直接浸提、26℃水浴浸提和水蒸氣蒸餾3種方法，乙醚、二氯甲烷和正己烷3種萃取劑對青楊脊虎天牛陳蛀屑進行萃取，發(fā)現(xiàn)萃取出的物質種類和數(shù)量也不同(表3)。

二氯甲烷直接浸提法(Z1)和水蒸氣蒸餾后，再用二氯甲烷(S1)和正己烷(W1)萃取出的物質種類都較少，分別只有6、6、10種。26℃水浴提取法和乙醚直接提取法所提取出的化合物種類較多，數(shù)量相近，特異性化合物也較多，但乙醚提取出的大分子甾醇類、烷類相對較多(表3)。所以提取陳蛀屑中的揮發(fā)性物質用26℃水浴浸提較為理想。

表3 不同萃取劑對陳蛀屑的萃取結果

2.3 青楊脊虎天牛對陳蛀屑和樹皮揮發(fā)物的EAG反應

青楊脊虎天牛對寄主植物的同一部位不會進行二次危害，因此試驗選取陳蛀屑中具有的鄰甲氧基苯甲醛、反式－1，2－環(huán)己二醇、N－乙基苯胺、苯并噻唑、棕櫚酸和寄主樹皮中提取的、存在廣泛的順－3－己烯醇及7號和8號混合物，進一步對其進行觸角電位和生物活性測定(表4)。

表4 青楊脊虎天牛雌、雄蟲對陳蛀屑和樹皮揮發(fā)物的EAG反應

由表4可知，除8號混合物和N－乙基苯胺外，青楊脊虎天牛雌蟲對其余物質的反應敏感程度都高于雄蟲。雌、雄蟲對N－乙基苯胺的反應值相近;對順－3－己烯醇和鄰甲氧基苯甲醛的反應趨勢相同即都在0.1 g·L－1出現(xiàn)最大值;7、8號混合物只有1種物質不同，即:7號混合物比8號多1份N－乙基苯胺，但EAG反應趨勢和反應值有明顯的差別。N－乙基苯胺本身不能引起青楊脊虎天牛雌、雄成蟲的明顯的EAG反應，但雌蟲對含有1份N－乙基苯胺的7號混合物(順－3－己烯醇、鄰甲氧基苯甲醛、N－乙基苯胺、苯并噻唑4種物質1∶1∶1∶1)發(fā)生強烈反應，是對照的8.7倍，說明N－乙基苯胺可能在引起青楊脊虎天牛雌蟲EAG反應的過程中，起著重要的協(xié)同作用;青楊脊虎天牛雌蟲對8號混合物各質量濃度EAG反應的敏感程度都低于雄蟲，也同樣可以說明N－乙基苯胺對引起青楊脊虎天牛雌蟲EAG反應的重要性。

2.4 青楊脊虎天牛對寄主揮發(fā)物的行為反應

青楊脊虎天牛對不同質量濃度的8種揮發(fā)物EAG反應結果表明，青楊脊虎天牛對N－乙基苯胺和棕櫚酸不同質量濃度的EAG反應值平緩而且反應值小。所以選擇順－3－己烯醇、鄰甲氧基苯甲醛、反式－1，2－環(huán)己二醇、苯并噻唑及其2種混合物的較大質量濃度做“Y”形管的生測試驗(表5)。行為生測結果表明，青楊脊虎天牛對這6種物質的反應率普遍低，最大反應率為80%，小于對α－蒎烯、松節(jié)油、水楊醛的反應率［13］。雌蟲對 1.0 g·L－1反式－1，2－環(huán)己二醇表現(xiàn)出顯著的驅避行為(P＜0.05)，對0.1 g·L－1苯并噻唑表現(xiàn)出顯著的誘引反應(P＜0.05);雄蟲對0.1、1.0 g/L－1的 7 號混合物均表現(xiàn)出顯著的驅避反應行為(P＜0.05)。順－3－己烯醇、鄰甲氧基苯甲醛和8號混合物對雌、雄蟲無明顯的定向作用。

表5 青楊脊虎天牛雌蟲、雄蟲對不同質量濃度寄主揮發(fā)物的行為反應

3 結論與討論

在很多情況下，EAG電位并不能代表昆蟲的行為反應，其原因主要有2點:第一，觸角去極化只能代表許多神經元對刺激物有所反應，并不能區(qū)分具體的行為作用。而氣味對昆蟲的行為作用是極其復雜的，除了定向作用外，還有抑制作用或增效作用。所以，EAG電位只能證明昆蟲對氣味是否有感知能力。第二，在昆蟲觸角中，少數(shù)神經元的反應也可能起重要的行為作用。EAG只是檢測整個觸角對化合物反應后電位的變化。因此不能僅靠昆蟲EAG反應程度來判定昆蟲行為反應的大?。?0］。植物創(chuàng)傷誘導揮發(fā)物的種類很多，主要組分有綠葉性氣味、萜烯類化合物、含氮化合物、含硫化合物以及其它化合物五大類，其中最常見的是萜烯類化合物和脂肪酸衍生物。目前，對天牛揮發(fā)物質的研究熱點也主要集中在烯萜類化合物上。本研究則廣泛選取非烯萜類化合物和混合物進行EAG和行為反應測試，鄰甲氧基苯甲醛、N－乙基苯胺、反式－1，2－環(huán)己二醇、苯并噻唑、棕櫚酸是樹皮揮發(fā)物中沒有而陳蛀屑中具有的成分。結果顯示，N－乙基苯胺在引起青楊脊虎天牛雌蟲EAG反應的過程中，起著重要的協(xié)同作用。所以，開展楊樹樹皮揮發(fā)性物質中非萜烯類化合物的單體和單體混配對青楊脊虎天牛作用的研究工作也將是未來工作的方向和發(fā)展目標。

行為生測結果表明，青楊脊虎天牛對順－3－己烯醇、鄰甲氧基苯甲醛、反式－1，2－環(huán)己二醇、苯并噻唑及2種混合物的反應率普遍較低，最大反應率為80%。而程紅［14］用α－蒎烯、松節(jié)油、水楊醛的試驗中，青楊脊虎天牛的反應率較高。這種情況與目前普遍使用的“Y”形管的設計和計算方法有關。青楊脊虎天牛停留在基部、入蟲口處的都視為無反應。本試驗中，青楊脊虎天牛向入蟲口處和通風口處爬行的數(shù)量較多。這種情況是藥劑的驅避作用，還是其它作用使然還有待進一步的研究。行為生測結果表明 1.0 g·L－1反式－1，2－環(huán)己二醇和 0.1 g·L－1苯并噻唑對青楊脊虎天牛雌蟲的驅避和誘引反應有顯著差異;對 0.1、1.0 g·L－1的 7 號混合物對雄蟲的驅避和誘引反應有顯著差異。青楊脊虎天牛雌、雄成蟲對單體和混合物的行為反應不同，也證明有必要進一步研究混合揮發(fā)物對青楊脊虎天牛的引誘作用。

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