趙霜李青時頌

(北京林業(yè)大學(xué)，北京，100083)

菊花‘神馬’(Chrysanthemum morifolium‘Shenma’)是由日本引進(jìn)的切花菊品種，其花色純白、花型優(yōu)美、品質(zhì)優(yōu)良，是近年來應(yīng)用較多的切花品種。我國種植的神馬菊主要出口日本。感染黃瓜花葉病毒的神馬菊，葉片表現(xiàn)出黃色的花葉癥狀，嚴(yán)重影響其觀賞價值。同時由于國內(nèi)和國際市場對切花菊的大量需求，病毒的侵染也給菊花的生產(chǎn)和銷售帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。傳統(tǒng)的扦插繁殖無法阻止病毒的傳播與擴(kuò)散，長期的無性繁殖會造成病毒積累、產(chǎn)生種性退化、產(chǎn)量降低、品質(zhì)變劣等后果。所以需要采取組織培養(yǎng)等手段脫除菊花體內(nèi)的病毒，以促進(jìn)商業(yè)化生產(chǎn)，擴(kuò)大經(jīng)濟(jì)效益。課題圍繞莖尖培養(yǎng)法展開，結(jié)合熱處理和病毒唑處理等手段，探討其對神馬菊脫毒效果的影響，從而找尋適合神馬菊脫毒的有效方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選用經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)檢驗(yàn)呈陽性的母株為供試材料，采取其頂芽及帶芽莖段為外植體。

1.2 試驗(yàn)方法

菊花組織培養(yǎng):將外植體清洗干凈，在流水下沖洗20 min，放入超凈臺。先用75%的酒精消毒1 min，無菌水涮洗3遍，每次3 min，再用0.1%的升汞滅菌8 min，最后用無菌水涮洗5遍，每次3 min。之后轉(zhuǎn)入到培養(yǎng)基 MS+6－BA1.0 mg/L+NAA0.1 mg/L中進(jìn)行初代培養(yǎng)。每28 d繼代一次，繼代培養(yǎng)基為MS+6－BA0.50 mg/L+NAA0.05 mg/L。

莖尖處理:初代培養(yǎng)30 d后，切取試管苗的頂芽和側(cè)芽。在4～8倍的解剖鏡下剝?nèi)∏o尖長度分別為0.2 ～0.3、0.4 ～0.5、0.6 ～0.8、0.9 ～1.0 mm 4個水平的莖尖，接種于培養(yǎng)基MS+6－BA0.40 mg/L+NAA0.04 mg/L，每水平接種30個莖尖，每28 d更新一次培養(yǎng)基。每7 d進(jìn)行一次觀察，28 d后統(tǒng)計(jì)成活率，49 d后統(tǒng)計(jì)脫毒率。

病毒唑+莖尖培養(yǎng):采用雙因子完全隨機(jī)區(qū)組的試驗(yàn)方法，病毒唑質(zhì)量濃度及莖尖長度的處理組合如表1所示，共9個處理，每處理接種10個莖尖，重復(fù)3次。將不同長度的莖尖接種于添加了不同質(zhì)量濃度病毒唑的培養(yǎng)基 MS+6－BA0.40 mg/L+NAA0.04 mg/L上，35 d后轉(zhuǎn)入正常培養(yǎng)基。每28 d更新一次培養(yǎng)基，以保證病毒唑的藥效以及莖尖生長對養(yǎng)分和水分的需求。每7 d進(jìn)行一次觀察，35 d后統(tǒng)計(jì)成活率，49 d后統(tǒng)計(jì)脫毒率。

表1 病毒唑質(zhì)量濃度與莖尖長度的處理組合

表2 病毒唑處理莖尖的隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)

熱處理+莖尖培養(yǎng):熱處理主要采用晝夜變溫并逐步升溫的方式，將經(jīng)壯苗后的試管苗置于人工氣候箱，白天起始溫度為28℃，每天升2℃升到38℃為止，夜間起始溫度為26℃，每天升2℃升至32℃為止。完成階段升溫后繼續(xù)處理30、45、60 d，光照時間設(shè)為14 h，光照強(qiáng)度設(shè)為80%，濕度設(shè)為60%，每個時間處理各60株試管苗。為保證試管苗對水分的需求，熱處理期間每15 d更新一次培養(yǎng)基。熱處理后對成活的試管苗剝?nèi)￠L度為0.4～0.5mm的莖尖接種于MS+6－BA0.40mg/L+NAA 0.04 mg/L培養(yǎng)基上，置于培養(yǎng)室進(jìn)行培養(yǎng)，28 d后統(tǒng)計(jì)成活率，49 d后統(tǒng)計(jì)脫毒率。

培養(yǎng)條件:培養(yǎng)室條件，溫度(24±1)℃，光照時間14 h/d，光照強(qiáng)度1 500～2 000 lx。成活率=(接種成活的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù))×100%;脫毒率=(脫除病毒的外植體數(shù)/成活的外植體數(shù))×100%。

1.3 檢測方法

采用癥狀觀察法和酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)對脫毒處理的試管苗進(jìn)行檢測。對于表現(xiàn)花葉癥狀的試管苗無需再進(jìn)行其他檢測，而對未表現(xiàn)癥狀的試管苗采用ELISA中的直接法對其進(jìn)行檢測(ELISA試劑盒購置于Agida公司)。

2 結(jié)果與分析

2.1 莖尖培養(yǎng)處理后莖尖長度與莖尖成活率、脫毒率的相關(guān)性

菊花莖尖在接入培養(yǎng)基后，7 d左右部分莖尖就出現(xiàn)膨大的現(xiàn)象(圖1)，特別是0.6 ～0.8、0.9 ～1.0 mm長的莖尖，14 d左右部分莖尖開始分化成芽(圖2)，同時有些莖尖褐化死亡，4周之后可統(tǒng)計(jì)成活率，莖尖生長49 d后成活的莖尖均可發(fā)育成完整的植株，可以進(jìn)行病毒檢測統(tǒng)計(jì)脫毒率。

圖1 一周左右的莖尖

圖2 二周左右的莖尖

由表3可以看出，隨著莖尖長度的增加，其成活率上升，但脫毒率卻下降，二者呈負(fù)相關(guān)。在綜合考慮成活率和脫毒率的情況下采用剝?nèi)?.4～0.5 mm的莖尖進(jìn)行脫毒培養(yǎng)，以減少工作量。

表3 不同長度莖尖的成活率和脫毒率

2.2 病毒唑結(jié)合莖尖培養(yǎng)脫毒處理后莖尖的成活率和脫毒率

2.2.1 病毒唑質(zhì)量濃度與莖尖長度及其成活率的相關(guān)性

由表4可見，隨著病毒唑質(zhì)量濃度的增加，同一長度莖尖的成活率下降，同時經(jīng)病毒唑處理的莖尖成活率低于直接剝?nèi)〉那o尖，如當(dāng)莖尖長度為0.4～0.5 mm、病毒唑質(zhì)量濃度為15 mg/L時，其成活率僅為30%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于直接剝?nèi)?.4～0.5 mm莖尖76.7%的成活率。但是只添加5 mg/L病毒唑的莖尖成活率與未添加病毒唑的莖尖相差不多，如當(dāng)莖尖長度為0.4～0.5 mm時，添加病毒唑的莖尖成活率只比未添加的低3.4%。因此，高質(zhì)量濃度的病毒唑會影響莖尖的生長，降低莖尖的成活率，并造成莖尖的死亡。

表4 病毒唑處理莖尖與直接剝莖尖成活率的差異 %

2.2.2 病毒唑結(jié)合莖尖培養(yǎng)處理后莖尖的脫毒率

表5是病毒唑處理莖尖后，莖尖脫毒個數(shù)的統(tǒng)計(jì)(每處理莖尖總數(shù)為10個)，其中A因子為莖尖長度，B因子為病毒唑質(zhì)量濃度。由此結(jié)果進(jìn)行方差分析，所得數(shù)據(jù)如表6所示。由F值比較可知，不同莖尖長度、不同病毒唑質(zhì)量濃度及它們之間的不同組合的脫毒效果差異均極顯著，區(qū)組之間差異不顯著。由于試管苗置于室內(nèi)培養(yǎng)，各處理所處條件均相同，所以區(qū)組之間無明顯差異。

表5 病毒唑處理莖尖的脫毒結(jié)果統(tǒng)計(jì) 個

為了進(jìn)一步找出脫除病毒的最佳組合，對差異極顯著的3個因子進(jìn)行差異的多重比較。q檢驗(yàn)結(jié)果(表7、8、9)表明，單獨(dú)比較莖尖長度對脫毒效果的差異時，0.4～0.5 mm的莖尖脫毒效果最好;單獨(dú)比較病毒唑質(zhì)量濃度時，添加10 mg/L的病毒唑的莖尖脫毒效果最好;比較A×B處理組合的差異時，發(fā)現(xiàn)0.4～0.5 mm的莖尖和添加了10 mg/L病毒唑的組合脫毒效果最好，這與單獨(dú)比較的結(jié)果相吻合，但0.4～0.5 mm的莖尖和添加了5 mg/L病毒唑的組合與最佳組合的差異不明顯，在生產(chǎn)上可以考慮使用。

表6 病毒唑處理莖尖的脫毒結(jié)果的方差分析

表7 A因子的多重比較

表8 B因子的多重比較

表9 A×B處理組合的多重比較

病毒唑處理莖尖(0.4～0.5 mm 莖尖，10 mg/L病毒唑)與直接剝莖尖(0.4～0.5 mm莖尖)成活率和脫毒率分別為 70.0%、76.7%，85.7%、65.2%。病毒唑處理莖尖的成活率較直接剝?nèi)∏o尖低了6.7%，但脫毒率卻提高了20.5%。由此可見，病毒唑結(jié)合莖尖培養(yǎng)比單獨(dú)剝?nèi)∏o尖的脫毒效果要好。

2.3 熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)脫毒處理后莖尖的成活率及脫毒率

熱處理可直接對外植體的母株進(jìn)行處理，也可以對試管苗進(jìn)行處理。黃瓜花葉病毒的致死溫度可達(dá)到60～65℃［1］，在此溫度下菊花植株會死亡，所以單純依靠熱處理無法達(dá)到理想的脫毒效果。由于菊花的耐熱性比較差，所以采取逐步升溫的方式［2］以達(dá)到過渡的目的，同時采用晝夜變溫的方式增加菊花植株的成活率。由表10可以看出，隨著熱處理時間的增加，植株的成活率逐漸降低，同時成活的植株剝?nèi)〉那o尖成活率也降低，但莖尖脫毒率卻上升，如熱處理60 d后莖尖成活率較未經(jīng)熱處理的莖尖低了45.1%，熱處理60 d后剝?nèi)〉那o尖其脫毒率可達(dá)到100%，與未經(jīng)熱處理的莖尖相比提高了34.8%。由于熱處理后剝?nèi)〉那o尖長度相同，因此熱處理對莖尖的成活率有影響。但考慮到成活率的關(guān)系，建議熱處理45 d后剝?nèi)?.4～0.5 mm的莖尖，這樣既能夠提高成活率又能夠節(jié)省時間，避免資源的浪費(fèi)。

表10 熱處理結(jié)合莖尖脫毒后莖尖的成活率及脫毒率

3 結(jié)論與討論

莖尖培養(yǎng)法是最常用的植物脫毒方法，其操作簡便，適用于多種植物材料，其脫毒原理是在莖尖分生區(qū)內(nèi)不存在維管束，病毒擴(kuò)散的速度沒有細(xì)胞分裂的速度快，病毒的復(fù)制受到旺盛代謝活動的限制，所以分生區(qū)病毒含量低［3］。但嚴(yán)格地講，莖尖分生組織僅限于頂端圓錐區(qū)內(nèi)長度不超過0.1 mm范圍內(nèi)［4］，而這種長度的莖尖成活率極低，菊花‘神馬’0.2～0.3 mm莖尖成活率僅有40%，這個比率雖然與很多其他植物相比高了很多，但考慮到剝?nèi)r操作的復(fù)雜性，建議菊花‘神馬’剝?nèi)?.4～0.5 mm長的莖尖用于脫除CMV最為適宜，這樣既能保證脫毒率，又能保證成活率。

常用的脫毒手段是溫度處理和化學(xué)藥劑處理，其中溫度處理分冷處理和熱處理，可根據(jù)病毒種類選擇恰當(dāng)?shù)姆椒?。在菊花感染的病毒中，菊花矮化病?CSV)和菊花褪綠斑駁病毒(CCMV)可經(jīng)5℃的冷處理后進(jìn)行莖尖脫毒培養(yǎng)［5］，而番茄不孕病毒(TAV)、煙草花葉病毒(TMV)、黃瓜花葉病毒(CMV)等病毒的熱致死溫度較高，除熱處理外還要輔助莖尖培養(yǎng)進(jìn)行脫毒。CMV的致死溫度達(dá)到60～65℃，而菊花‘神馬’的耐熱性不好，無法單純依靠熱處理達(dá)到脫毒的效果，所以選擇熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)的方法進(jìn)行脫毒培養(yǎng)。由于前期試驗(yàn)中0.4～0.5 mm的莖尖成活率和脫毒率都很高，所以熱處理后選擇剝?nèi)?.4～0.5 mm的莖尖進(jìn)行脫毒培養(yǎng)。菊花‘神馬’熱處理30 d后剝?nèi)〉那o尖脫毒率有84%，處理60 d后可達(dá)到100%。但熱處理時間不宜過長，否則不僅植株本身會死亡，熱處理后剝?nèi)〉那o尖成活率也會大幅下降，熱處理60 d后剝?nèi)〉那o尖成活率僅為31.6%。這個比例是采用晝夜變溫及逐步升溫的結(jié)果，在前期恒溫?zé)崽幚淼念A(yù)試驗(yàn)中成活率更低。在綜合考慮成活率和脫毒率的前提下，在熱處理45 d后，剝?nèi)【栈ā耨R’的莖尖進(jìn)行培養(yǎng)比較適宜。化學(xué)藥劑處理是比較方便的一種脫毒手段，常用的抗病毒化學(xué)藥物有三氮唑核苷(病毒唑)、5－二氫尿嘧啶(DHT)、環(huán)已酰胺、放線菌素－D等，其中病毒唑是應(yīng)用最為廣泛的一種試劑。雖然它對多種植物病毒都有較好的脫除作用，但是實(shí)際應(yīng)用中還是存在一些問題，如對植物會有不同程度的藥害［6］，所以要避免長期使用。因此本研究選擇病毒唑的處理時間為35 d，以避免產(chǎn)生藥害。病毒唑質(zhì)量濃度越高脫毒的效果越好，經(jīng)研究在添加了病毒唑的培養(yǎng)基中，不同長度莖尖的脫毒率較未經(jīng)病毒唑處理的莖尖均有所提高。但由于病毒唑存在抑制植物生長、造成褐化等副作用，經(jīng)病毒唑處理過的莖尖較未經(jīng)病毒唑處理的莖尖生長緩慢，且成活率有所下降，如0.4～0.5 mm的莖尖在經(jīng)15 mg/L的病毒唑處理35 d后，其成活率為30%，比未經(jīng)病毒唑處理的莖尖低了46.7%。所以菊花‘神馬’可剝?nèi)?.4～0.5 mm長的莖尖，接種于添加了10 mg/L病毒唑的培養(yǎng)基，培養(yǎng)35 d來脫除CMV，這樣既可保證脫毒率又能使莖尖正常的生長。本研究對病毒唑的質(zhì)量濃度及莖尖的長度進(jìn)行了篩選，但是具體的處理時間還有待進(jìn)一步探討。

植物組織培養(yǎng)脫毒方法中還有很多其他的方式，如愈傷組織培養(yǎng)、花藥和花粉培養(yǎng)、珠心培養(yǎng)等［7］，這些方法在其他感染病毒的植物身上也取得了很好的脫毒效果，但是專門針對菊花脫毒的研究還沒有。此外原生質(zhì)體培養(yǎng)［8］也是可以進(jìn)行脫毒培養(yǎng)的方法，這種方法在煙草等植物上取得了很好的效果。因此脫毒的方法有很多，菊花脫毒的研究還可以從這些方面開展，從而找尋最佳的脫毒方式。

［1］ 吳元華，韋石來，劉忠智，等.美人蕉黃瓜花葉病毒和菜豆黃花葉病毒研究［J］.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1995，26(4):359－362.

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［3］ 楊鵬輝，王仁睿，劉軍，等.菊花脫毒無害化技術(shù)研究進(jìn)展［J］.陜西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011(1):89－92，108.

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