趙曉妮 孫鳳陽 尹 靜 由香玲

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

龍牙楤木(Aralia elata(Miq.)Seem.)，又名遼東楤木、刺老芽等，屬五加科楤木屬(Aralia L.)植物［1］，為重要的食、藥兼用的植物。其嫩芽含有人體必需的多種氨基酸和微量元素［2］，根皮和樹皮性味辛苦，有小毒，具有補氣安神、強精滋腎、祛風(fēng)活血、除濕止痛的功效［3］。近年來的研究顯示龍牙楤木皂苷在免疫調(diào)節(jié)、腫瘤防治方面有很顯著的作用［4］。但是，龍牙楤木的野生資源由于破壞性、掠奪性地進(jìn)行連年多茬采收，其資源量急劇下降，黑龍江省已將其列為瀕危珍稀植物，其高效繁殖也顯得尤為重要而迫切。

體胚發(fā)生方式是一種高效快繁方法。關(guān)于龍牙楤木體胚發(fā)生的研究報道已有不少，例如:Amemiya et al.［5］利用10年生龍牙楤木樹上的冬芽在含有2，4－D 的 MS 培養(yǎng)基中誘導(dǎo)產(chǎn)生了體胚;Kang et al.［6］在含2，4－D的培養(yǎng)基中，從龍牙楤木毛狀根中誘導(dǎo)了體胚;Dai et al.［7］利用IBA誘導(dǎo)了體細(xì)胞胚發(fā)生等?，F(xiàn)報道的研究主要是外植體選擇和利用植物生長調(diào)節(jié)劑建立體胚快速繁殖體系。在本研究過程中發(fā)現(xiàn)，高溫脅迫能夠誘導(dǎo)龍牙楤木次生體胚發(fā)生。高溫誘導(dǎo)體胚發(fā)生的實例有胡蘿卜和油菜，其中，37℃高溫處理胡蘿卜的頂芽后轉(zhuǎn)入無任何植物生長調(diào)節(jié)劑培養(yǎng)基中誘導(dǎo)了體胚發(fā)生［8］;油菜花芽內(nèi)小孢子經(jīng)高溫處理后，誘導(dǎo)了前期體胚［9］。但研究者們未深入分析其中的原因，僅從體胚發(fā)生角度研究了這種誘導(dǎo)體胚發(fā)生的方法。事實上，高溫脅迫會使外植體各種生理狀態(tài)發(fā)生變化，其中一項重要的生理變化是抗氧化酶的變化。因為脅迫產(chǎn)生了大量的活性氧，可使細(xì)胞膜脂過氧化而傷害細(xì)胞［10］。文中詳細(xì)介紹了37℃高溫誘導(dǎo)次生體胚的過程，為高效快速繁殖龍牙楤木提供更簡便快捷的方法;同時考察了高溫處理過程中及次生體胚發(fā)生過程中3種抗氧化物酶(SOD、POD、CAT)活性的變化特征，從生理活性角度揭示了高溫脅迫處理對體胚誘導(dǎo)的作用。

1 材料與方法

次生體胚誘導(dǎo):本試驗在先前的研究中，通過無菌實生苗根誘導(dǎo)(在1/2SH+2.0 mg·L－1IBA+20 g·L－1蔗糖的固體培養(yǎng)條件下)獲得了大量龍牙楤木成熟子葉體胚［7］。從中選取1.5 cm長的成熟子葉體胚，接種于不含有任何植物生長調(diào)節(jié)劑，添加20 g·L－1蔗糖的WPM固體培養(yǎng)基中，置于培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)0～3 d，取出放置于培養(yǎng)室進(jìn)行暗培養(yǎng)誘導(dǎo)次生體胚。每個培養(yǎng)瓶中接種8個體細(xì)胞胚，每個處理接種10瓶。每次取0.2 g，每隔5 d取樣1次，共取5次，迅速放入冰箱－40℃保存，留作抗氧化酶活性分析。上述培養(yǎng)基均添加3 g·L－1水晶洋菜(gelrite，Duchefa－Postubus Haarlem，Netherlands)，pH 值為5.8，經(jīng)過高溫高壓滅菌(121 ℃、0.152 MPa、15 min)后使用。材料在常規(guī)組織培養(yǎng)室中培養(yǎng)(溫度(23±1)℃，暗培養(yǎng)，濕度60% ～70%)。

SOD、POD、CAT活性測定:將龍牙楤木體胚材料置于預(yù)冷的研缽中，加1.0 mL預(yù)冷的0.05 mol·L－1磷酸緩沖液(pH值為7.8)在冰浴上研磨成漿后，轉(zhuǎn)入離心管中加0.05 mol·L－1磷酸緩沖液(pH值為7.8)使終體積為 5.0 mL。然后在 4 ℃、10 000 r·min－1離心15 min，取上清液作為粗酶液于冰箱中4℃冷藏，用于測定超氧化物歧化酶、過氧化物酶和過氧化氫酶活性分析。

超氧化物歧化酶(SOD)活性采用NBT光還原法測定［11］;過氧化物酶(POD)活性采用0.3%愈創(chuàng)木酚法［11］測定;過氧化氫酶(CAT)活性采用240 nm比色法［11］測定。

數(shù)據(jù)分析:數(shù)據(jù)采用Excel 2003進(jìn)行整理及作圖處理，應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行Tukey多重比較分析和相關(guān)性分析，所得數(shù)據(jù)均為3次的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫脅迫誘導(dǎo)龍牙楤木次生體細(xì)胞胚發(fā)生

龍牙楤木成熟體細(xì)胞胚在恒溫培養(yǎng)箱中37℃處理0～3 d，接種于無任何植物生長調(diào)節(jié)劑的WPM培養(yǎng)基中培養(yǎng)21 d，都有次生體細(xì)胞胚發(fā)生(圖1A、B、C)。觀察發(fā)現(xiàn)，在此過程中10～15 d是次生體細(xì)胞胚發(fā)生的時期，此后20～25 d基本是體細(xì)胞胚發(fā)育成長的時期。與未進(jìn)行高溫處理的對照和處理1 d的外植體相比，高溫處理3 d的外植體材料變褐，且平均每個體胚上產(chǎn)生次生體細(xì)胞胚的數(shù)量較少，約2個(表1)。統(tǒng)計次生體胚的誘導(dǎo)情況(表1)顯示，高溫處理外植體1 d，次生體胚的誘導(dǎo)情況較好，誘導(dǎo)率和體胚誘導(dǎo)數(shù)量分別為58%和4個，顯著高于對照(P＜0.05);但是隨著高溫處理時間的延長，體胚的誘導(dǎo)率逐漸下降，均顯著低于對照(P＜0.05)，而且高溫處理3d的體胚誘導(dǎo)率略低于處理2 d的，無顯著差異(P＞0.05)。結(jié)果表明，合適的高溫脅迫有利于次生體胚發(fā)生。

圖1 成熟體胚經(jīng)高溫處理后在無任何植物生長調(diào)節(jié)劑的WPM培養(yǎng)基中誘導(dǎo)的次生體胚

表1 高溫處理0～3 d的體細(xì)胞胚在無任何植物生長調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)次生體細(xì)胞胚的情況

2.2 高溫脅迫誘導(dǎo)龍牙楤木次生體胚發(fā)生過程中抗氧化酶活性分析

2.2.1 高溫脅迫處理及次生體胚發(fā)生過程中SOD活性變化

經(jīng)高溫處理1～3 d的龍牙楤木體胚與未處理的相比，SOD活性都有所升高，但是升高幅度不大(取材時間為0 d)(表2)。在體細(xì)胞胚發(fā)生過程中，與對照相比，在第5 d SOD活性都有所下降，到第10 d時，SOD活性達(dá)到最高峰，之后各處理的SOD活性呈下降趨勢。第10～15 d是胚性細(xì)胞形成時期。在第5～10 d，未處理材料中的SOD活性都高于處理的;而在第15 d處理材料的SOD活性都高于未處理的。且整個次生體胚發(fā)生過程中，處理1 d外植體中SOD的活性均較高。

2.2.2 高溫脅迫處理及次生體胚發(fā)生過程中POD活性變化

龍牙楤木體胚經(jīng)高溫處理后，與對照相比，各個處理的POD活性均下降(取材時間為0～5 d)(表2)。處理后在次生體胚發(fā)生過程中，胚性細(xì)胞的形成時期，即第10 d POD活性迅速上升至最高，而且高溫處理1 d的POD活性最高，隨后其活性下降，且活性基本不變。表明POD活性升高可促進(jìn)次生體胚發(fā)生和胚性細(xì)胞的早期發(fā)育，而高溫脅迫1 d更利于體胚發(fā)生的形成。

表2 高溫脅迫處理及次生體胚發(fā)生過程中SOD、POD、CAT活性變化

2.2.3 高溫脅迫處理及次生體胚發(fā)生過程中CAT活性變化

龍牙楤木體胚經(jīng)高溫處理后，與對照相比，各處理的CAT活性均呈下降趨勢(取材時間為0 d)(表2)。在次生體胚發(fā)生過程中，CAT活性逐漸升高，在第15 d CAT活性達(dá)到最高，而后其活性雖有小幅下降，但維持在一個較高的水平。高溫處理1 d外植體的CAT活性相對其他處理的較高，而且在次生胚性細(xì)胞形成期第15 d活性達(dá)到最高，其后維持在較高水平。由此可知次生體胚的發(fā)生發(fā)育過程中，CAT活性均升高。崔凱榮等［12］在研究枸杞的體胚發(fā)生過程中發(fā)現(xiàn)，CAT在繼代愈傷組織中的活性很高，隨著胚性細(xì)胞的形成酶活性降低，到分化培養(yǎng)3 d時出現(xiàn)酶活性的低谷，隨著胚性細(xì)胞的分裂、發(fā)育，這種酶活性又開始逐漸升高，成熟胚期活性升到和繼代愈傷組織大致相同水平。而與本研究體胚發(fā)生過程不太一致?？赡苡捎诒狙芯客庵搀w材料預(yù)先進(jìn)行的高溫脅迫改變了其變化趨勢。

通過對高溫脅迫處理后龍牙楤木體胚SOD、POD、CAT活性的變化進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，得出POD與CAT活性之間的相關(guān)系數(shù)r=0.983，P=0.017＜0.05，表明兩者呈顯著正相關(guān)，且龍牙楤木體胚隨著高溫脅迫處理時間的延長，POD與CAT活性都顯著低于對照組(P＜0.05)，龍牙楤木體胚的POD與CAT完全失去保護(hù)作用;而SOD與POD、CAT活性呈一定的負(fù)相關(guān)，但不顯著(P＞0.05)，龍牙楤木體胚隨著高溫脅迫處理時間的延長，SOD活性略高于對照組，差異不顯著(P＞0.05)，表明高溫脅迫處理后龍牙楤木體胚中SOD可能對其活性氧的清除起到關(guān)鍵作用;在龍牙楤木次生體胚發(fā)生過程中3種抗氧化酶活性之間相關(guān)性不顯著。

3 結(jié)論與討論

植物體在遭受高溫脅迫后，細(xì)胞內(nèi)將積累大量的活性氧［13－15］，誘使細(xì)胞內(nèi)合成表達(dá)抗氧化酶類以消除或緩解活性氧對細(xì)胞的毒害作用。作為內(nèi)源性保護(hù)酶，SOD負(fù)責(zé)催化·轉(zhuǎn)變?yōu)镠2O2，并在過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD)的作用下將其分解為H2O和O2，消除高溫脅迫產(chǎn)生的活性氧對細(xì)胞的傷害［16］。本研究發(fā)現(xiàn)，高溫脅迫龍牙楤木體胚誘導(dǎo)次生體胚發(fā)生過程中，3種抗氧化酶活性均有明顯變化。高溫脅迫均使POD和CAT活性降低，而SOD活性則升高。在次生體胚發(fā)生過程中，3種過氧化物酶活性均有顯著的變化。在胚性細(xì)胞分化的早期(第10、15 d)，處理外植體的POD、SOD活性相對較高，CAT活性較低。在體胚發(fā)育過程中(第15 d以后)，SOD和POD活性都呈顯著下降趨勢(P＜0.05)，而CAT活性維持在較高的水平。由此可推測，SOD和POD對次生體胚誘導(dǎo)起主導(dǎo)作用，而CAT對體胚的發(fā)育和成熟起關(guān)鍵作用。本試驗結(jié)果同時也表明，在次生體胚發(fā)生過程中，3種抗氧化物酶(SOD、POD、CAT)相互配合來調(diào)節(jié)胚性細(xì)胞的發(fā)生與發(fā)育過程，與陳義挺等［17］對龍眼體胚發(fā)生早期POD活性研究結(jié)果一致。處理1d外植體為合適的處理，其活性均高于其他處理，而其次生體胚誘導(dǎo)率相對較高。3種過氧化物酶活性的規(guī)律性變化，可能是在不同的細(xì)胞器中進(jìn)行，從而使體胚發(fā)生過程氧化系統(tǒng)維持在一個適宜的水平，以消除高溫對體胚發(fā)生的影響。在花楸體胚發(fā)生過程中，研究者發(fā)現(xiàn)，SOD、POD活性均在胚性細(xì)胞向球形胚轉(zhuǎn)化時下降，球形胚向心形胚發(fā)育時下降，心形胚向魚雷形胚和魚雷形胚向子葉形胚發(fā)育時再升高;CAT活性變化規(guī)律與SOD、POD活性變化不同［18］，這可能是不同材料的體胚發(fā)生過程中抗氧化系統(tǒng)的協(xié)調(diào)方式不同所致。

許多資料顯示，一定濃度的H2O2對體胚產(chǎn)生有促進(jìn)作用。枸杞體胚發(fā)生的研究發(fā)現(xiàn)，適量濃度的H2O2對枸杞胚性細(xì)胞的形成和體細(xì)胞胚的發(fā)育有促進(jìn)作用;過高的H2O2則有抑制作用［19］。本研究的高溫脅迫，同樣也產(chǎn)生了大量活性氧。H2O2作為一種細(xì)胞信號傳遞物質(zhì)，可以通過細(xì)胞的信號傳遞系統(tǒng)影響基因的調(diào)控表達(dá)。胚性細(xì)胞的形成過程，即細(xì)胞的分化過程，其核心是基因的差異表達(dá)，H2O2可能在分子水平上誘導(dǎo)胚胎的發(fā)生［12］。

崔凱榮等［12］在枸杞的體胚發(fā)生過程中發(fā)現(xiàn)，在胚性愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基后，隨著胚性細(xì)胞的形成，SOD活性逐漸升高，當(dāng)胚性細(xì)胞進(jìn)一步分裂形成體細(xì)胞胚時，SOD活性達(dá)到最高峰，表明SOD活性升高對胚性細(xì)胞的分化及胚胎發(fā)育具有促進(jìn)作用。原海云等［20］以連翹為試驗材料，研究高溫脅迫對連翹細(xì)胞SOD活性的影響發(fā)現(xiàn)，在12～24 h，高溫脅迫時間與連翹細(xì)胞SOD活性呈正相關(guān)，這與本試驗結(jié)果相一致。根據(jù)本試驗3種抗氧化物酶的相關(guān)分析表明，POD與CAT活性呈顯著正相關(guān)(r=0.983)，POD、CAT活性能夠準(zhǔn)確地反映高溫脅迫龍牙楤木體胚發(fā)生隨處理時間的變化趨勢，這對研究龍牙楤木次生體胚的發(fā)生具有一定的指導(dǎo)意義。

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