李秀霞，孫協(xié)軍，馮彥博，李 嬌，勵建榮

（渤海大學化學化工與食品安全學院，遼寧錦州121013）

凌棗又稱鈴棗，其果樹耐寒、抗貧瘠，適應性強，是遼西地區(qū)的特色栽培品種，主要分布在遼寧省凌源市。凌棗果實脆甜，凌棗棗果富含多糖、氨基酸和多種維生素及礦物質(zhì)，屬鮮食品種。有研究表明，凌棗中總黃酮含量為棗果之首[1]，主要包括蘆丁、藥黃素和黃酮-C-葡萄糖苷等黃酮類化合物等[2]。這些黃酮類生物活性物質(zhì)具有很高的營養(yǎng)保健價值，可起到消炎止咳、降血壓、降血脂、增進冠狀動脈血流量和防治冠心病、心絞痛等作用，經(jīng)常食用有增進人體健康的功效。對凌棗功能性成分進行開發(fā)利用，對于促進凌源棗業(yè)的發(fā)展和滿足人們對天然保健食品的需求具有重要的意義。本實驗以遼西凌棗黃酮為研究對象，探討不同部位凌棗黃酮的含量和抗氧化活性，為凌棗功能性食品的研究和應用開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

凌棗 購于當?shù)厥袌?；蘆丁 色譜純，中國生物制品檢定所；2，2-二苯基苦基苯肼（DPPH） 美國Sigma-aldrich公司；鄰二氮菲 天津市大茂化學試劑廠；焦性沒食子酸 國藥集團化學試劑有限公司；三氟乙酸 天津大茂化學試劑廠；其他試劑 均為分析純。

P680型液相色譜儀 美國戴安公司；AD雙反型超純水機 上海訊輝環(huán)?？萍加邢薰荆籘U1901型紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器公司；A-2004型電子分析天平 上海恒平科學儀器有限公司；RE-2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水真空泵、101B-2型電熱鼓風干燥箱 上海申光儀器儀表有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蘆丁標準溶液的配制 以甲醇為溶劑配成質(zhì)量濃度為1g/L的蘆丁對照品貯備液，使用時分別稀釋成系列濃度：0.02、0.06、0.10、0.20、0.50、1g/L。

1.2.2 色譜條件 參照彭艷芳[2]棗果蘆丁HPLC分析方法進行，有所改動，具體條件為流動相及比例：甲醇/水（80∶20，v/v），流速：1.0mL/min，進樣量：20μL，柱溫：40℃。

1.2.3 待測樣品的制備

1.2.3.1 凌棗預處理 選擇飽滿完整的凌棗分為3份，用冷水沖洗，去除凌棗表面附著的塵土、泥沙，水蒸汽蒸30min后立即放入冷水中浸泡、剝皮。凌棗果皮、果肉、果核及全棗分別于65℃電熱鼓風干燥箱內(nèi)烘干，粉碎機粉碎，過40目篩后裝袋密封，置于干燥器中貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.2 凌棗黃酮提取方法 準確稱取干燥至恒重的棗粉1.000g置于250mL圓底燒瓶中，加入一定體積和濃度的乙醇溶液，在設定溫度恒溫水浴中加熱回流提取一定時間后抽濾，收集濾液并蒸干溶劑后，用30%乙醇溶液定容至刻度，即為待測液。

1.2.3.3 黃酮得率的計算 以提取液黃酮得率作為考查指標，黃酮得率計算式為：S（%）=cv/m×100

式中：S—黃酮得率，mg/g；c—提取液蘆丁含量，mg/mL；v—提取液定容體積，mL；m—棗粉質(zhì)量，g。

1.2.4 還原力測定 參照Oyaizu和榮建華等的方法[3-4]。取2.0mL不同濃度的樣品（2～50mg/mL）或抗壞血酸溶液（標準參照物），加入2.0mL pH6.6的磷酸鹽緩沖液（0.2mol/L）和2.0mL 1%（w/v）的鐵氰化鉀溶液，混勻，在50℃保溫20min后迅速冷卻，向混合液中加入2.0mL 10%（w/v）的三氯乙酸溶液，混勻后以655.2×g離心10min。取上清液2.5mL，加入2.5mL蒸餾水和0.5mL 0.1%（w/v）的三氯化鐵溶液，然后在700nm波長下比色，以水為空白。吸光值越大，則樣品的還原力越強。

1.2.5 清除羥自由基能力的測定 以鄰二氮菲-亞鐵化學法測定羥自由基能力清除能力[5]。取7.5mmol/L鄰二氮菲溶液1mL置于試管中，依次加入0.2mol/L的pH7.40磷酸緩沖液2mL和樣品液1mL，充分混合后，加入0.75mmol/L硫酸亞鐵液1mL，混勻，加入1mL 0.01% H2O2，于37℃下溫育60min，于536nm測其吸光度值，記為AS。用1mL蒸餾水代替1mL H2O2，測得的吸光度稱AB?？瞻坠芤?.00mL蒸餾水代替1.00mL樣品作為參照，測得的吸光度為AP，羥自由基清除能力按以下公式計算：

1.2.6 清除DPPH自由基能力測定 參照Suda描述的方法進行測定[6]。利用DPPH溶液的特征紫紅色團的吸收峰，用分光光度法測定加不同濃度的抗氧化劑或樣品后在517nm吸收的變化表示其對有機自由基的清除能力。取2.0mL水解液，加入1.0mL 0.2mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.0）和2.0mL 0.2mmol/L DPPH乙醇溶液，混合均勻，于室溫下暗處放置20min，然后在517nm下測定其吸光值，自由基DPPH的清除能力以清除率計算：

式中：A1—DPPH溶液+樣品溶液的吸光度；A2—DPPH溶劑+樣品溶液的吸光度；A0—DPPH溶液+樣品溶劑的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標準曲線的建立及凌棗黃酮的色譜分離結(jié)果

經(jīng)紫外可見光分光光度計掃描，甲醇溶液中蘆丁標準品最大吸收波長為360nm，因此，選擇檢測波長為360nm。凌棗全棗粉中主要的黃酮類組分為蘆?。ㄒ妶D1）[2，7]，圖2為蘆丁標樣的液相色譜圖。由色譜工作站處理數(shù)據(jù)，以峰面積-質(zhì)量濃度作圖（圖形未給出），以蘆丁峰面積X為橫坐標，相對應的質(zhì)量濃度Y（g/L）為縱坐標，得到蘆丁標準曲線為：Y=0.0019X-0.0031，R2=0.9995，線性區(qū)間為0.02～1.00g/L，按3倍信噪比（N/S）計算，蘆丁的檢出限為：0.23μg/L。

圖1 凌棗全棗黃酮提取液色譜圖Fig.1 Chromatogram of flavonoid extract from entire ling jujube

圖2 蘆丁標樣色譜圖Fig.2 Chromatogram of rutin standard

2.2 凌棗黃酮提取實驗結(jié)果

以75%的乙醇溶液作提取劑，在提取溫度65℃，提取時間1.5h，液固比30∶1（mL/g）條件下，提取不同部位凌棗黃酮并測定含量，測得結(jié)果表明凌棗去核全棗、棗肉、棗核和棗皮蘆丁含量分別為（3.60±0.32）、（3.85±0.27）、（0.40±0.05）、（3.50±0.65）mg/g，凌棗棗肉和棗皮中黃酮含量稍高于棗核，考慮去核全棗原料豐富易得，并易于處理，以下提取參數(shù)優(yōu)化實驗均以凌棗去核全棗（簡稱凌棗）為原料來進行。

2.2.1 提取劑濃度對凌棗黃酮得率的影響 固定提取溫度65℃，提取時間1.5h，液固比30∶1（mL/g），考查提取劑濃度對凌棗黃酮得率的影響。實驗結(jié)果如圖3所示，隨著乙醇濃度增大，黃酮得率增加。當提取劑濃度為80%時提取量最大，提取效果最好，其后濃度升高，提取量反而下降。其原因可能是當提取劑濃度超過80%時，凌棗全棗粉中一些雜質(zhì)隨之溶出，對提取過程產(chǎn)生了干擾，從而使黃酮得率下降，因此選用濃度為80%的乙醇濃度進行正交實驗。

圖3 提取劑濃度對凌棗黃酮得率的影響Fig.3 Effect of extractant concentration on ling jujube flavonoid yield

2.2.2 液固比對凌棗黃酮得率的影響 固定乙醇濃度75%，提取時間1.5h，提取溫度75℃，考查液固比對凌棗黃酮得率的影響，實驗結(jié)果如圖4所示。凌棗黃酮得率隨液固比增加而增大，當液固比為30∶1～50∶1（mL/g）時黃酮提取效果最好，之后黃酮得率略有降低，這是由于凌棗中黃酮含量有限，當提取溶劑用量達到一定程度后，對黃酮的提取已基本完成，再增加溶劑用量對提取得率沒有提高，而且液固比過大增加生產(chǎn)成本，浪費溶劑，并對后續(xù)濃縮工作帶來較多不便，因此選用液固比30∶1（mL/g）為宜。

圖4 液固比對凌棗黃酮得率的影響Fig.4 Effect of ratio of liquid to solid on ling jujube flavonoid yield

2.2.3 提取溫度對凌棗黃酮得率的影響 固定乙醇濃度75%，提取時間1.5h，液固比30∶1（mL/g），考查提取溫度對凌棗黃酮得率的影響，實驗結(jié)果如圖5所示。提取溫度對提取效果影響較大，隨著提取溫度的升高，凌棗黃酮得率呈逐漸上升趨勢，說明溫度越高，黃酮在提取劑中的溶解度越大，提取效果越好，同時可初步判斷凌棗黃酮耐熱性好。75℃時黃酮得率達最大值，到85℃時略有下降，說明凌棗黃酮提取的最適提取溫度在75℃左右。一般認為，提取溫度是增大得率的有效方式，隨著溫度的升高，溶劑的分子運動速度加快，滲透、擴散、溶解速度加快，從而使黃酮更易于從棗粉細胞轉(zhuǎn)移至提取溶劑中，但由于溫度升高會溶出較多雜質(zhì)，同樣會干擾黃酮的浸出。因此，選擇凌棗黃酮的提取溫度75℃進行正交實驗。

圖5 提取溫度對凌棗黃酮得率的影響Fig.5 Effect of extraction temperature on ling jujube flavonoid yield

2.2.4 提取時間對凌棗黃酮得率的影響 固定乙醇濃度75%，提取溫度75℃，液固比30∶1（mL/g），考查提取時間對凌棗黃酮得率的影響，實驗結(jié)果如圖6所示。凌棗黃酮得率隨提取時間的延長而增加，提取時間為1.5h時提取效果最好，之后延長提取時間，提取量增長幅度平緩，說明黃酮提取已基本完成，再延長提取時間對黃酮得率沒有大的提高，較長時間的提取會增加能源消耗和生產(chǎn)成本，降低制備效率，故提取時間不宜過長，因此選用提取時間為1.5h。

圖6 提取時間對凌棗黃酮得率的影響Fig.6 Effect of extraction time on ling jujube flavonoid yield

2.2.5 正交實驗結(jié)果 根據(jù)單因素實驗結(jié)果，以乙醇濃度、提取溫度、料液比、提取時間為考查因素，選用L9（34）正交表安排設計正交實驗，以黃酮得率為考查指標，并對各因素水平結(jié)果進行極差分析，得出正交實驗結(jié)果。依據(jù)正交實驗結(jié)果，確定并驗證最佳制備工藝條件。

正交實驗設計及結(jié)果分析見表1。運用極差進行數(shù)據(jù)分析處理后得到結(jié)果為：RB＞RD＞RC＞RA，即影響凌棗棗肉黃酮類化合物提取效果的因素依次為：液固比＞提取時間＞提取溫度＞乙醇濃度，最佳因素水平為A1B2C2D3，即最佳工藝水平為液固比30∶1（mL/g）、提取時間2h、提取溫度75℃、乙醇濃度75%。經(jīng)驗證，在此條件下，凌棗粉中黃酮類化合物得率為5.01mg/g。

表1 正交實驗設計及結(jié)果分析Table 1 Results of extracting orthogonal tests

2.3 抗氧化實驗結(jié)果

2.3.1 還原力測定結(jié)果 還原力測定結(jié)果見圖7，凌棗黃酮提取液的還原力隨著提取液黃酮濃度的增加而增加，可以推測凌棗提取物中的具有電子供體作用的黃酮類物質(zhì)，通過提供電子而使自由基形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)從而終止了自由基的鏈式反應。在0.15～0.73mg/mL濃度范圍內(nèi)，凌棗不同部位黃酮還原力大小依次為：棗肉黃酮＞全棗黃酮＞棗核黃酮＞棗皮黃酮。

圖7 凌棗黃酮和維生素C的還原力測定結(jié)果Fig.7 Reducing power of ling jujube flavonoid extract and ascorbic acid

2.3.2 羥自由基清除能力 本實驗中，羥自由基是由Fe2+和H2O2反應而產(chǎn)生的，凌棗黃酮含有的酚羥基在反應生成的羥自由基和氧自由基的清除作用中起著氫供體的作用，還原氧化性自由基[8-9]。羥自由基清除率測定結(jié)果見圖8，在0.29～3.50mg/mL濃度范圍內(nèi)，凌棗各部位黃酮提取液羥自由基清除能力均隨著濃度的增加而增大。凌棗不同部位黃酮清除羥自由基能力的順序依次為：棗肉黃酮＞全棗黃酮＞棗核黃酮＞棗皮黃酮。

2.3.3 DPPH自由基清除能力 DPPH清除能力測定結(jié)果見圖9，凌棗不同部位黃酮對DPPH自由基的清除能力大小依次為：棗肉黃酮＞全棗黃酮＞棗核黃酮＞棗皮黃酮，綜合以上結(jié)果，凌棗棗肉中可能含有較高活性或較高含量的活性黃酮組分。

圖8 凌棗黃酮和維生素C清除羥自由基的能力Fig.8 Hydroxyl radical scavenging activity of ling jujube flavonoid extract and ascorbic acid

圖9 凌棗黃酮和維生素C的DPPH自由基清除能力Fig.9 DPPH scavenging activity of ling jujube flavonoid extract and ascorbic acid

3 結(jié)論

對凌棗黃酮回流提取工藝進行了優(yōu)化，得到最佳工藝條件為：液固比30∶1（mL/g）、提取時間2h、提取溫度75℃、乙醇濃度75%。在此條件下，凌棗棗肉黃酮得率為5.01mg/g。凌棗不同部位黃酮還原力和羥自由基及DPPH自由基清除能力順序均為：棗肉黃酮＞全棗黃酮＞棗核黃酮＞棗皮黃酮，說明凌棗棗肉中含有較高活性或較高含量的黃酮類物質(zhì)。

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