劉 曦，祝連彩，王伯初

（重慶大學生物工程學院，生物流變科學與技術教育部重點實驗室，重慶400044）

人體在新陳代謝過程中會產(chǎn)生大量的活性氧（ROS）[1]，包括超氧陰離子自由基（O2-·）、羥自由基（·OH）、脂氧自由基等自由基和過氧化氫（H2O2）等非自由基基團，它們具有強氧化性，會嚴重損害機體的組織和細胞[2]，是很多疾病如動脈粥樣硬化、心血管疾病、大腦功能障礙和風濕病等產(chǎn)生的重要原因[3]。大量文獻報道，很多中草藥、水果、蔬菜具有抗氧化活性，并且從這些食用及藥用植物中尋找低毒、安全、有效的天然抗氧化劑已成為抗氧化劑發(fā)展的必然趨勢[4-6]。藍莓，又稱越橘、藍漿果，屬杜鵑花科（Ericaceae）越橘屬（Vaccinium）多年生落葉或常綠灌木。藍莓果實中有大量的黃酮、多酚、花青素等活性物質(zhì)，且有較高的抗氧化活性[7]，但其昂貴的價格極大的限制了藍莓的廣泛應用，進而人們把注意力轉移到藍莓葉上。有報道藍莓葉中含有總酚、原花青素等[8]。此外，藍莓葉提取物有降血糖[9]、降血脂[10]、預防癌癥[11]等藥理作用，因此有必要對藍莓葉進行研究以考察其在食品、藥品等方面的應用潛力。對藍莓葉抗氧化活性雖有報道，但都是用80%乙醇[10]、70%丙酮[12]等提取，缺乏系統(tǒng)性的研究，因此本論文用不同極性溶劑提取藍莓葉，對其提取物中的總酚和黃酮含量進行測定，并運用DPPH自由基、ABTS自由基、β-胡蘿卜素-亞油酸體系等方法考察藍莓葉不同極性溶劑提取物體外抗氧化能力，旨在為系統(tǒng)開發(fā)藍莓植物資源在食品、醫(yī)藥和保健領域的應用提供實驗支持。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

藍莓葉樣品 于2011年9月采自貴州省麻江縣藍莓種植基地，經(jīng)重慶大學生物工程學院李正國教授鑒定為兔眼藍莓（Vaccinium blueberry）葉；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、亞油酸、β-胡蘿卜素、Folin-Ciocalteu 美國Sigma公司；沒食子酸、蘆丁、三氯化鋁、2，6-二叔丁基對甲酚（BHT）、2，2-聯(lián)氮基雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）等 均為國產(chǎn)分析純。

Lambda 900 型紫外分光光度計 美國Perlin Elmer公司；SPX-250B-D型振蕩培養(yǎng)箱 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；BUCHI R205-V800型旋轉蒸發(fā)儀 瑞士Buchi公司；冷凍干燥機 北京醫(yī)博康實驗儀器有限公司；干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司；FA2004型電子分析天平 上海恒平科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 藍莓葉不同溶劑提取工藝 將新鮮藍莓葉置于55℃干燥箱中干燥，粉碎過20目篩得藍莓葉粉末，分別精密稱取適量的藍莓葉粉末6份，按1∶40（g/mL）比例加入不同提取溶劑（蒸餾水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、氯仿、石油醚），在水浴鍋上回流提取3次，各2h（煮沸后）。抽濾后得不同溶劑提取液，在旋轉蒸發(fā)儀上減壓濃縮至近干時，用少量溶劑轉移到蒸發(fā)皿中，經(jīng)冷凍干燥得藍莓葉不同溶劑提取物。精密稱取各提取物，分別用50%甲醇溶解為質(zhì)量濃度為2.0mg/mL的母液，置于-4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 總酚含量測定[13]總酚含量用Folin-Ciocalteu試劑測定。

沒食子酸標準曲線繪制：精密稱取10.0mg沒食子酸標準品，用50%甲醇溶解成濃度為2.5mg/mL的標準液。準確吸取標準品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL移入EP管中，加50%甲醇至1.0mL。取不同濃度標準品溶液各0.1mL，加入1.0mL 50% Folin-Ciocalteu試劑，混合1min后加入2.0mL 0.2g/L碳酸鈉溶液，再用蒸餾水定容至5.0mL，充分振蕩混勻后于25℃黑暗條件下溫育2h，在760nm的波長處測定吸光值（A）。以沒食子酸的質(zhì)量濃度為縱坐標（Y），吸光值為橫坐標（X），繪制標準曲線，得回歸方程為Y=11.24X-1.013，R2=0.997，線性范圍為2.0～10.0μg/mL。

總酚含量的測定：分別精密量取待測液0.1mL，按線性關系考察方法在760nm處測定吸光值，并根據(jù)沒食子酸的標準曲線，計算各樣品的總酚含量。

1.2.3 總黃酮含量測定[14]總黃酮含量用三氯化鋁顯色法測定。

蘆丁標準曲線繪制：精密稱取17.5mg蘆丁標準品，用50%甲醇溶解成濃度為2.5mg/mL的標準液。準確吸取標準品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，移入EP管中，各加50%甲醇至1.0mL。取不同濃度的標準品溶液0.5mL，向其中加入0.1g/L AlCl3100μL，1mol/L醋酸酐100μL，加蒸餾水使其反應體系為3.0mL，充分振蕩后于室溫條件下放置30min，在415nm的波長處測定吸光值（A）。以蘆丁的質(zhì)量濃度為縱坐標（Y），吸光值為橫坐標（X），繪制標準曲線，得回歸方程為Y=31.32X+0.087，R2=0.999，線性范圍為4.17～27.78μg/mL。

總黃酮含量測定：分別精密量取待測液0.5mL，按線性關系考察方法在415nm處測定吸光值，并根據(jù)蘆丁的標準曲線，計算各樣品的總黃酮含量。

1.2.4 抗氧化活性測定

1.2.4.1 清除DPPH自由基測定[15]0.1mL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液和1.9mL 0.09mmol/L DPPH乙醇溶液混合，劇烈振蕩后置黑暗條件下反應30min，在517nm波長處測定吸光度。以不加樣品為空白對照，用2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）為陽性對照，對DPPH自由基的清除率按式（1）計算。

式中：Ao為空白樣品吸光度；As為待測樣品吸光度。

EC50值定義為清除50%自由基所需的樣品質(zhì)量濃度，其計算是通過獲得的抑制DPPH自由基回歸方程所得。以待測樣品濃度為橫坐標（X），抑制率為縱坐標（Y）得待測樣品清除DPPH自由基的關系曲線。計算得到待測樣品的半數(shù)抑制濃度（EC50）。

1.2.4.2 清除ABTS自由基測定[16]在濃度為7mmol/L ABTS溶液中加入過硫酸鉀使其終濃度為2.45mmol/L，充分混合均勻，將混合反應液在室溫避光的條件下放置12～16h（ABTS反應液須新鮮配制，保留的最長時間為3d）。在EP管中加入200μL樣品溶液、300μL ABTS反應液，然后加入0.5mL 50%甲醇溶液，充分振蕩均勻，反應2min后，在745nm處測定吸光度。以不加樣品為空白對照，用BHT作為陽性對照，對ABTS自由基的清除率按式（1）計算。

以待測樣品濃度為橫坐標（X），抑制率為縱坐標（Y）得待測樣品清除ABTS自由基的關系曲線。計算得到待測樣品的半數(shù)抑制濃度（EC50）。

1.2.4.3 β-胡蘿卜素/亞油酸體系中抗脂質(zhì)過氧化作用的測定[17]在250mL旋轉蒸發(fā)瓶中，加入1.0mL 0.2mg/mL的β-胡蘿卜素氯仿溶液，再依次加入25μL亞油酸和200mg土溫-40，混合均勻后，旋轉蒸發(fā)氯仿，然后加入100mL氧飽和蒸餾水，劇烈振蕩即得反應液。取上述反應液2400μL加入反應管中，加入不同濃度梯度的待測樣品溶液100μL。在470nm處測定起始吸光度，50℃溫育2h后再測定吸光度。以不加樣品溶液的β-胡蘿卜素/亞油酸體系作為空白對照。用BHT作為陽性對照，對脂質(zhì)過氧化抑制率按式（2）計算。

式中：Aco、Act分別為空白樣品起始和溫育2h后的吸光度；Aso、Ast分別為待測樣品起始和溫育2h后的吸光度。

IC50值定義為反應被抑制一半時所需的樣品濃度，其計算是通過獲得的抗脂質(zhì)過氧化能力的回歸方程所得。以待測樣品濃度為橫坐標（X），脂質(zhì)過氧化抑制率為縱坐標（Y）得待測樣品抗脂質(zhì)過氧化能力的關系曲線。計算得到待測樣品的半數(shù)效應濃度（IC50）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實驗數(shù)據(jù)均為3次重復實驗結果的平均值。采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，方差分析運用Duncan極差法，數(shù)據(jù)以x±SD表示。

2 結果與分析

2.1 藍莓葉提取物中有效成分含量

6種不同藍莓葉提取物中總酚和黃酮含量測定結果見表1。結果表明，藍莓葉提取物中總酚和黃酮含量隨提取溶劑的不同而有所變化。水提取物的總酚含量最高，為（264.67±0.29）mg/g，隨著提取溶劑極性的減小，含量逐漸減低，石油醚提取物的總酚含量最低，僅（10.12±0.20）mg/g；甲醇提取物中的黃酮含量最多，為（68.94±0.08）mg/g，然后依次是乙醇、水、乙酸乙酯提取物，分別是（59.99±0.05）mg/g、（53.34±0.02）mg/g、（37.02±0.06）mg/g，而氯仿、石油醚提取物中黃酮含量較少，僅3mg/g左右。

表1 不同溶劑的藍莓葉提取物有效成分測定結果（n=3）Table 1 Total phenols and flavonoids contents of different extracts from Vaccinium blueberry leaves（n=3）

2.2 不同溶劑提取物清除DPPH自由基能力

DPPH自由基清除法已被廣泛應用于從水果、蔬菜和天然中藥材提取物等中，篩選抗氧化活性物質(zhì)[18]。由圖1可知，不同溶劑提取物對DPPH自由基表現(xiàn)出強弱不一的清除能力，且在一定濃度范圍內(nèi)（0.5～100.0μg/mL）呈明顯的量效關系，其中水提取物對DPPH自由基的清除能力最強，其次是甲醇，均強于對照品2，6-二叔丁基對甲酚（BHT）；樣品濃度在0.5～10.0μg/mL時，乙醇提取物的DPPH自由基清除能力比BHT強，隨著濃度的增大，BHT的清除能力大于乙醇提取物；如表2和圖1所示，相對于對照品BHT的EC50（23.96±0.03）μg/mL，水提物和甲醇提取物較小，分別為（12.78±0.10）、（18.74±0.02）μg/mL，各物質(zhì)清除DPPH自由基能力為：水提取物＞甲醇提取物＞BHT＞乙醇提取物＞乙酸乙酯提取物＞氯仿提取物＞石油醚提取物，氯仿提取物和石油醚提取物差異不顯著（p＞0.05），即氯仿提取物和石油醚提取物清除DPPH自由基能力相當，且活性很小。

2.3 不同溶劑提取物清除ABTS自由基能力

ABTS自由基清除法目前已被廣泛應用于親水性和親脂性物質(zhì)總抗氧化能力的測定[19]。由圖2可知，不同極性溶劑提取物對ABTS自由基表現(xiàn)出強弱不一的清除能力，且在一定的濃度范圍（0.4～12.9μg/mL）呈明顯的量效關系。低濃度時，水提物對ABTS+·的清除率較陽性對照BHT強，但隨著濃度的增大，BHT的清除活性增強。當樣品濃度為12.9μg/mL時，各物質(zhì)的ABTS自由基清除率分別為74.26%、63.88%、56.72%、16.96%、5.61%和4.66%。如圖2各物質(zhì)的半數(shù)清除濃度所示，物質(zhì)清除ABTS自由基的能力為：水提取物＞BHT＞甲醇提取物＞乙醇提取物＞乙酸乙酯提取物＞氯仿提取物＞石油醚提取物，但BHT和甲醇、乙醇提取物，氯仿提取物和石油醚提取物差異不顯著（p＞0.05），表示甲醇提取物與乙醇提取物清除ABTS自由基能力與BHT相當，氯仿提取物和石油醚提取物清除ABTS自由基能力相當。

圖2 不同提取物清除ABTS自由基能力Fig.2 ABTS radical scavenging activity of different extracts from Vaccinium blueberry leave

表2 藍莓葉不同極性溶劑提取物清除自由基EC50和抗脂質(zhì)過氧化IC50Table 2 EC50 of scavenging capacities for free radicals and IC50 of anti-lipid peroxidation of different extracts from Vaccinium blueberry leaves

2.4 不同提取物的抗脂質(zhì)過氧化能力

由圖3可知，不同極性提取物表現(xiàn)出強弱不一的抗脂質(zhì)過氧化能力，在一定的濃度范圍（0.2～80.0μg/mL）呈現(xiàn)量效關系，但其抗脂質(zhì)過氧化能力均小于陽性對照BHT，具有顯著性差異（p＜0.05）；如表2所示，水提物、甲醇提取物對β-胡蘿卜素淬滅的抑制能力的IC50分別為（25.33±0.02）μg/mL、（60.87±0.09）μg/mL，而乙醇、乙酸乙酯、石油醚提取物的IC50均大于80μg/mL，結合圖3，各提取物的抗脂質(zhì)過氧化能力為：水提取物＞甲醇提取物＞乙醇提取物＞乙酸乙酯提取物＞氯仿提取物＞石油醚提取物，氯仿提取物和石油醚提取物差異不顯著（p＞0.05），表示氯仿提取物和石油醚提取物抗脂質(zhì)過氧化能力相當，且能力均較弱。

圖3 不同提取物抗脂質(zhì)過氧化能力Fig.3 The activity of anti-lipid peroxidation of different extracts from Vaccinium blueberry leave

2.5 總酚和黃酮含量與抗氧化活性的相關性

如表3所示，濃度為20μg/mL的不同溶劑藍莓葉提取物中總酚含量與抗氧化能力之間有較好的相關性，其中ABTS自由基清除能力、抗脂質(zhì)過氧化能力與總酚的R2在0.97以上，對DPPH自由基的清除能力的相關系數(shù)也達到0.93，相關性極顯著（p＜0.01），可以認為藍莓葉提取物中總酚含量的多少直接反映提取物抗氧化能力的強弱。黃酮含量與DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力以及抗脂質(zhì)過氧化能力的相關系數(shù)分別為0.840、0.823、0.638，有顯著的相關性（p＜0.05），因此黃酮含量的多少與提取物抗氧化能力具有相關關系。

表3 藍莓葉不同溶劑提取物總酚和黃酮與抗氧化活性的相關性（C=20μg/mL）Table 3 The correlation between content of the total phenols and flavonoids and the activity of different extracts from Vaccinium blueberry leaves（C=20μg/mL）

3 結果與討論

為獲得可信的結論，本研究采用DPPH自由基清除體系、ABTS自由基清除體系和β-胡蘿卜-亞油酸體系對藍莓葉不同極性溶劑提取物的抗氧化能力進行了綜合評價。研究表明，藍莓葉不同溶劑提取物的抗氧化活性存在較大差異，但三種評價體系所得出的其抗氧化能力的順序一致，即水提取物＞甲醇提取物＞乙醇提取物＞乙酸乙酯提取物＞氯仿提取物＞石油醚提取物。水提物具有極強的清除自由基的活性，活性顯著大于化學抗氧化劑BHT，差異顯著（p＜0.01）；具有中等強度的抗脂質(zhì)過氧化的能力，半數(shù)抑制濃度為（25.33±0.02）μg/mL。很多研究均表明天然提取物的抗氧化的能力強于化學合成的抗氧化劑，如Mehmet[20]發(fā)現(xiàn)薄荷提取物的清除DPPH自由基的活性優(yōu)于陽性對照BHT，Masoumeh等[21]在研究艾菊提取物的抗氧化活性時發(fā)現(xiàn)其DPPH自由基清除活性比陽性對照BHT好。在已報道的對藍莓葉抗氧化的研究中，主要使用的提取溶劑為有機類溶劑，如Marian[12]等用70%丙酮、Zhao等[22]用60%乙醇提取藍莓葉測定提取物的抗氧化活性，但本研究證明以水作為提取溶劑能夠獲得抗氧化活性最好的提取物。

已有大量的研究表明，酚類化合物是天然植物提取物中具有抗氧化活性的主要物質(zhì)基礎，而黃酮類化合物是植物為抵抗外部環(huán)境，如紫外線等產(chǎn)生的一類含量最為豐富酚類化合物。因此本實驗測定了各提取物的總酚和總黃酮的含量，并應用SPSS 17.0對總酚和總黃酮的含量與抗氧化活性的相關性進行了統(tǒng)計分析。結果表明，總酚含量與提取物抗氧化活性具有極顯著相關性（p＜0.01），與總黃酮含量具有顯著相關性（p＜0.05），這提示藍莓葉中除黃酮類化合物外，還存在其他具有抗氧化活性的酚類化合物，另外結合水提物的總酚含量最高、活性最強可以推斷藍莓葉中存在的其他抗氧化成分的極性相對比較大。因此可以選擇總酚含量作為藍莓葉抗氧化提取物質(zhì)量評價的指標。

如今人們越來越重視自身的健康和食品的營養(yǎng)要求，從植物中提取天然抗氧化劑是食品和醫(yī)療保健行業(yè)發(fā)展的一種趨勢。本研究表明相對于有機溶劑，水提物的抗氧化活性好、活性成分含量高，避免了有機溶劑殘留問題，為藍莓葉保健品的研究與開發(fā)進行了有益的探索，促進藍莓資源的綜合開發(fā)和利用。

[1] Cadenas E，Davies K. Mitochondrial free radical generation，oxidative stress，and aging[J].Free Radical Biology and Medicine，2000，29：222-230.

[2] Slater T F. Free-radical mechanism in tissue injury[J].Biochemical Journal，1984，222：1-15.

[3] Drige W. Free radical in the physiological control of cell function[J]. Physical Review，2001，82：47-95.

[4] 楊錦華，李博，籍保平. 我國常見食用和藥用植物的抗氧化性研究[J]. 食品科學，2006，27（6）：87-91.

[5] Cai Y Z，Luo Q，Sun M，et al. Antioxidant activity and phenolic compounds of 112 traditional Chinese medicinal plants associated with anticancer[J]. Life Science，2004，74：2157-2184.

[6] Lee S E，Hwang H J，Ha J S，et al. Screening of medicinal plant extracts for antioxidant activity[J]. Life Science，2003，73：167-179.

[7] Huang W Y，Zhang H C，Liu C Y，et al. Survey of antioxidant capacity and phenolic composition of blueberry，blackberry，and strawberry in Nanjing[J]. Journal of Zhejiang University-SCIENCE B（Biomedicine and Biotechnology），2012，13（2）：94-102.

[8] Ehlenfeldt M K，Prior R L. Oxygen Radical Absorbance Capacity（ORAC）and phenolic and anthocyanin concentrations in fruit and leaf tissues of highbush blueberry[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2001，49：2222-2227.

[9] Watson E M. Some observations on the effect of blueberry leaf extract in diabetes mellitus[J]. The Canadian Medical Association Journal，1928：166-171.

[10] Li Y C，Li B X，Geng L J. Hypolipidemic and antioxidant effects of total flavonoids from blueberry leaves[J]. European Food Research and Technology，2011，233：897-903.

[11] Mechikova G Y，Kuzmich A S. Cancer-preventive activities of secondary metabolites from leaves of the bilberry Vaccinium smallii A. gray[J]. Phytotherapy Research，2010，24：1730-1732.

[12] Marian N，Ryszard A，Ryszard Z D，et al. Antioxidant activity of crude phenolic extracts from wild blueberry leaves[J].Polish Journal of Food and Nutrition Science，2003，53（12）：166-169.

[13] Singleton V L，Orthofer R，Lamuela -Raventòs R M.Analysis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of Folin-Ciocalteu reagent[J]. Methods in Enzymol，1999，299：152-178.

[14] Awah F M. Uzoegwu P N，Ifeonu P，et al. Free radical scavenging activity，phenolic contents and cytotoxicity of selected Nigerian medicinal plants[J]. Food Chemistry，2012，131：1279-1286.

[15] Duan X W，Jiang Y M，Su X G，et al. Antioxidant properties of anthocyanins extracted from litchi（Litchi chinenesis Sonn.）fruit pericarp tissues in relation to their role in the pericarp browning[J]. Food Chemistry，2007，101：1365-1371.

[16] Garzon G A，Wrolstad R E. Major anthocyanins and antioxidant activity of Nasturium flowers（Tropaeolum majus）[J].Food Chemistry，2009，114：44-49.

[17] Yesilyurt V，Halfon B，Ozturk M，et al. Antioxidant potential and phenolic constituents of Salvia cedronella[J].Food Chemistry，2008，108：31-39.

[18] Sanchez M C. Review：methods used to evaluate the free radical scavenging activity infoods and biological systems[J].Food Science and Technology International，2002（8）：121-137.

[19] Re R，Pellegrini N，Proteggente A，et al. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay[J]. Free Radical Biology and Medicine，1999，26：1231 -1237.

[20] Mehmet O. Anticholinesterase and antioxidant activities of Savoury（Satureja thymbra L.）with identified major terpenes of the essential oil[J]. Food Chemistry，2012，134：48-54.

[21] Masoumeh F，Zahra T，Ali S. Essential oil composition and antioxidant of the various extracts of Tanacetum sonbolii Mozaff.（Asteraceae）from Tran[J]. Nature Product Research，2012，26（23）：2204-2207.

[22] Zhao H T，Wang Z Y，Cheng C L，et al. In-vitro free radical scavenging activities of anthocyanins from three berries [J].Journal of Medicinal Plants Research，2012，6（1）：101-107.